[發明專利]通過無標記基因缺失產生的用于控制流行性嗜水氣單胞菌的疫苗

在審

• 申請號: 201580041911.1
• 申請日: 2015-05-28
• 公開（公告）號: CN107810265A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發明（設計）人: 馬克·R·萊爾斯;杰弗里·S·特胡納;約瑟夫·C·牛頓;穆罕默德·J·侯賽因;孫大偉;查爾斯·瑟洛
• 申請（專利權）人: 奧本大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/02;C12N15/74;A61P31/04
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司11219
• 代理人: 楊青,穆德駿

1.一株減毒氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)細菌，其通過重組被遺傳修飾成缺乏與O-抗原莢膜合成或分泌相關的一種或多種基因，所述基因選自：

(a)編碼YmcA多肽(SEQ ID NO：11)的基因或編碼與YmcA多肽(SEQ ID NO：11)具有至少95％序列同一性的多肽的基因；和

(b)編碼YmcC多肽(SEQ ID NO：19)的基因或編碼與YmcC多肽(SEQ ID NO：19)具有至少95％序列同一性的多肽的基因；和

(c)(a)和(b)兩者。

2.權利要求1的減毒氣單胞菌屬，其中所述細菌選自嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)和維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)。

3.權利要求1的減毒氣單胞菌屬細菌，其中所述細菌已經通過下述方法進行遺傳修飾，所述方法包括(a)通過重組使ymcA基因的至少一部分缺失，并插入可選擇標記代替ymcA基因的缺失部分，和(b)隨后使所述可選擇標記缺失以產生缺乏ymcA基因的無標記細菌。

4.權利要求3的減毒氣單胞菌屬細菌，其中所述細菌已經通過以下進行遺傳修飾：(a)將重組工程系統轉移到所述細菌中，其中所述重組工程系統使ymcA基因的至少一部分缺失，并用側翼為兩個重組酶識別靶位點的可選擇標記取代所述部分；(b)選擇表達所述可選擇標記的細菌；(c)消除所選擇細菌的重組工程系統；(d)將表達重組酶的載體轉移到所選擇的細菌中，其中所述重組酶識別兩個重組酶識別靶位點；(e)選擇不表達所述可選擇標記的細菌；和(f)消除所選擇細菌的重組酶表達載體。

5.權利要求4的減毒氣單胞菌屬細菌，其中所述重組工程系統包括：可移動的重組工程載體；和以5'至3'順序包含以下連續序列的線性DNA分子：(i)與基因ymcA(SEQ ID NO：12)具有序列同一性的至少10個核苷酸的第一核苷酸序列，(ii)包含第一個重組酶識別靶位點的第二核苷酸序列，(iii)表達可選擇標記的第三核苷酸序列，(iv)包含第二個重組酶識別靶位點的第四核苷酸序列，和(v)與(i)的第一核苷酸序列不同的、與基因ymcA(SEQ ID NO：12)具有序列同一性的至少10個核苷酸的第五核苷酸序列，其中在重組酶表達后，重組酶重組重組酶識別靶位點以除去可選擇標記，并且被缺失的ymcA基因的部分被一個重組酶識別靶位點替代。

6.權利要求1中的減毒氣單胞菌屬細菌，其中所述細菌還通過重組進行遺傳修飾以缺乏編碼YmcB多肽(SEQ ID NO：17)的基因或缺乏編碼與YmcB多肽(SEQ ID NO：17)具有至少95％序列同一性的多肽的基因。

7.一種疫苗組合物，其包含權利要求1的減毒氣單胞菌細菌和載體。

8.權利要求7的疫苗組合物，其中所述減毒氣單胞菌屬細菌已通過化學處理或物理處理滅活。

9.一種接種水生動物以抵抗氣單胞菌屬細菌感染的方法，所述方法包括向所述水生動物施用權利要求7的疫苗組合物。

10.權利要求9的方法，其中所述水生動物是斑點叉尾鮰。

11.權利要求9的方法，其中通過腹腔內注射給所述水生動物施用所述疫苗組合物。

12.權利要求9的方法，其中以遞送10⁴-10⁸CFU減毒氣單胞菌屬細菌每個水生動物的劑量向所述水生動物施用所述疫苗組合物。

13.權利要求9的方法，其中通過將所述水生動物浸沒在包含所述疫苗組合物的水性介質中來給所述水生動物施用所述疫苗組合物。

14.權利要求13的方法，其中所述水性介質具有10⁴-10⁸CFU/ml的減毒氣單胞菌屬細菌的濃度。