[發(fā)明專利]使用重疊非等位基因特異性引物和等位基因特異性阻斷劑寡核苷酸的組合物進行等位基因特異性擴增

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580039304.1
• 申請日: 2015-05-19
• 公開（公告）號: CN106661627B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發(fā)明（設計）人: D·Y·張;吳若嘉;王玨皛
• 申請（專利權）人: 威廉馬歇萊思大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C40B30/04;C07H21/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長;陳揚揚

1.一種非診斷性擴增靶序列的方法，所述方法包括步驟：

(a).提供樣品，所述樣品含一或多拷貝的第一核酸并含至少一拷貝的第二核酸，所述第一核酸含變體序列，所述第二核酸含所述靶序列，其中所述靶序列和變體序列各自包含同源子序列和可變子序列，其中所述可變子序列含至少一個核苷酸，并且其中所述靶序列的可變子序列是靶特異性子序列并且所述變體序列的可變子序列是非靶特異性子序列；

(b).將DNA阻斷劑寡核苷酸引入所述樣品，其中所述DNA阻斷劑寡核苷酸包含具有靶中性子序列和阻斷劑可變子序列的第一序列，其中所述靶中性子序列具有第一部分和第二部分，其中所述靶中性子序列與所述同源子序列的部分互補并且所述阻斷劑可變子序列與所述非靶特異性子序列互補，其中所述阻斷劑可變子序列在其3’端被所述靶中性子序列的第一部分側接而5’端被所述靶中性子序列的第二部分側接并且與該靶中性子序列的第一和第二部分連續(xù)，并且，其中所述DNA阻斷劑寡核苷酸在3’端或3’端附近包含功能基團或非互補序列區(qū)域，其阻止酶促延伸；和

(c).將第一DNA引物寡核苷酸引入所述樣品，其中所述第一DNA引物寡核苷酸足以誘導酶促延伸，其中所述第一DNA引物寡核苷酸包含第二序列，其中所述第二序列與所述同源子序列的第二部分互補，其中所述第二序列與所述靶中性子序列重疊至少5個核苷酸，從而所述第二序列包含重疊子序列和非重疊子序列，并且其中所述第二序列不包含任何與所述阻斷劑可變子序列互補的序列；

(d).向所述樣品引入DNA聚合酶、三磷酸核苷和基于聚合酶的核酸擴增所需的一種或多種試劑；和

(e).在足以實現核酸擴增的條件下使所述樣品反應；

其中第一DNA引物寡核苷酸的所述第二序列產生與靶序列的雜交標準自由能ΔG°_PT，并且DNA阻斷劑寡核苷酸的所述第一序列產生與靶序列的雜交標準自由能ΔG°_BT，兩者滿足下述條件：

+2kcal/mol≥ΔG°_PT-ΔG°_BT≥-8kcal/mol；

并且，其中所述第一DNA引物寡核苷酸的非重疊子序列產生與靶序列的雜交標準自由能ΔG°₃，其滿足下述條件：

-4kcal/mol≥ΔG°₃≥-12kcal/mol。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述功能基團包含3-碳間隔子或雙脫氧核苷酸。

3.如權利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。

4.如權利要求3所述的方法，其中所述足以實現核酸擴增的條件包括將樣品暴露于至少10個循環(huán)，其中各循環(huán)包括至少2個不同溫度暴露，一個溫度暴露至少85℃，一個溫度暴露不高于75℃。

5.如權利要求1所述的方法，其還包含將選自下組的酶引入所述樣品的步驟：切口酶、重組酶、解旋酶、RNA酶、逆轉錄酶或其任何組合。

6.如權利要求1所述的方法，其中所述重疊子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分，其中所述部分為5個核苷酸至40個核苷酸。

7.如權利要求1所述的方法，其中所述重疊子序列包含所述靶中性子序列的5’端的部分，其中所述部分為7個核苷酸至30個核苷酸。

8.如權利要求1所述的方法，其中所述DNA阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一引物寡核苷酸的濃度高2-10000倍。

9.如權利要求1所述的方法，其中所述DNA阻斷劑寡核苷酸的濃度比被引入所述樣品的第一DNA引物寡核苷酸的濃度高5-1,000倍。