[發(fā)明專利]用于擴增核酸樣品的等溫方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580038542.0
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號: CN106661600B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·R·諾布爾;J·戴維森
• 申請（專利權(quán)）人: 唐恩生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 中國貿(mào)促會專利商標事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 羅菊華

1.一種非診斷目的的兩階段核酸擴增和實時檢測方法，所述方法包括：

a.提供包含靶核酸模板和至少一種引物的組合物，所述引物與所述靶核酸模板在靠近待擴增的目標區(qū)域處退火；

b.進行第一核酸擴增反應(yīng)以擴增所述目標區(qū)域，由此形成初級擴增子；

c.將(b)分成至少兩個二級反應(yīng)，并且位點特異性二級引物包括在至少一個所述二級反應(yīng)中，所述位點特異性二級引物與可存在于所述初級擴增子內(nèi)并界定所述目標區(qū)域內(nèi)的目標位點的位點特異性引物結(jié)合位點互補，其中錯配二級引物包括在至少另一個二級反應(yīng)中，并且所述錯配二級引物相對于所述位點特異性二級引物僅在待檢測位點處的位置錯配，以及所述錯配二級引物和所述位點特異性二級引物在其他位置可包含相同的錯配；

d.僅在所述位點特異性引物結(jié)合位點與所述位點特異性二級引物互補時進行第二核酸擴增反應(yīng)，由此加速所述目標區(qū)域的擴增；以及

e.實時檢測并比較所述至少兩個二級反應(yīng)的擴增速率，其中與包括錯配二級引物的另外的二級反應(yīng)相比，在具有所述位點特異性二級引物的反應(yīng)中提高的相對擴增速率指示存在與所述位點特異性二級引物互補的所述目標位點。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一核酸擴增是等溫核酸擴增反應(yīng)。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二核酸擴增是等溫核酸擴增反應(yīng)。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括正向和反向環(huán)形成引物。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(a)包括正向和反向置換引物。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述等溫核酸擴增反應(yīng)是LAMP。

7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述等溫核酸擴增反應(yīng)是LAMP-STEM。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述初級擴增子是多聯(lián)體。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述位點特異性二級引物包含與突變、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、等位基因或所述初級擴增子上的生物標記物互補的3’端核苷酸。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述錯配二級引物包含與等位基因、突變或多態(tài)性錯配的3’端核苷酸或互補的3’端核苷酸。

11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進行第二核酸擴增反應(yīng)的步驟包括在熒光標記或染料存在下的擴增，由此標記所述擴增產(chǎn)物。

12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述實時檢測和比較所述至少兩個二級反應(yīng)的擴增速率的步驟包括檢測和比較來自每個所述反應(yīng)的熒光信號。

13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述第一核酸擴增反應(yīng)之前，將所述引物和模板加熱至95℃的溫度持續(xù)1分鐘至15分鐘。

14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一核酸擴增和第二核酸擴增反應(yīng)在55℃至65℃的溫度下進行。

15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一核酸擴增反應(yīng)在第一反應(yīng)室中進行，所述第一反應(yīng)室包括與多個第二反應(yīng)室單向流體連通的通道，且其中步驟(c)包括將近似相等體積的(b)經(jīng)由所述通道從所述第一反應(yīng)室運送到所述第二反應(yīng)室。

16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴增反應(yīng)的相對反應(yīng)速率滿足以下條件：

以位點特異性二級引物進行的第二核酸擴增反應(yīng)大于以非互補的錯配二級引物進行的第二核酸擴增反應(yīng)。

17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中位點特異性二級引物的擴增反應(yīng)的Cq比錯配二級引物的擴增反應(yīng)快至少25％。