[發(fā)明專利]通過TALEN平臺(tái)技術(shù)的甜菜原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580031432.1
• 申請(qǐng)日: 2015-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN106715697A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蓋伊·魏恩斯;馬克·勒菲弗;夏夫高達(dá)·塔姆曼納高達(dá);米里耶勒·隆梅爾;羅松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西斯凡德爾哈維公眾公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11240
• 代理人: 張英,宮傳芝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明處于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及通過外源序列有效轉(zhuǎn)化甜菜原生質(zhì)體的方法和方式(或工具)。

背景技術(shù)

在植物遺傳學(xué)領(lǐng)域中，一直需要通過同源重組(基因靶向)修飾染色體的能力，這是因?yàn)榛虬邢蚩梢园邢蛱禺愋孕蛄谢蚝塑账幔瑥亩鴮?dǎo)致特定植物功能的修飾并開創(chuàng)用于作物改善、用于具有所需碳水化合物譜或具有提高的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的新種子的產(chǎn)量提高，或用于提高對(duì)疾病和應(yīng)激的耐受性的新的可能性。

來源于黃單胞菌屬(xanthomonas)的植物病原體細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)(TALEN)序列在疾病中起重要作用并通過結(jié)合宿主DNA和激活效應(yīng)子-特異性宿主基因來引起防御。TALEN's是特異性轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(人工限制酶)，其可以設(shè)計(jì)成結(jié)合并切割基因組中的特異性DNA序列。一旦將這些TALEN's引入細(xì)胞，則它們可以用于基因組編輯。

這些核酸酶序列和它們的衍生蛋白允許有效靶向和/或加工雙鏈核酸序列。

它們的衍生蛋白是由核心骨架組成的特異性嵌合蛋白單體，所述核心骨架包含對(duì)靶序列具有結(jié)合特異性的重復(fù)可變二肽區(qū)(Repeat Variable Dipeptide region)(RVD)，所述靶序列在其N末端部分融合了催化結(jié)構(gòu)域。該催化結(jié)構(gòu)域(其可以是核酸酶的單體)，位于可能與融合至另一TAL單體的另一催化結(jié)構(gòu)域相互作用的位置，從而當(dāng)兩個(gè)單體結(jié)合至其各自靶標(biāo)DNA序列時(shí)，兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域?qū)⑿纬煽赡芗庸ぴ摪行蛄懈浇腄NA的催化實(shí)體(catalytic entity)。

國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2011/072246描述了通過使用該轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(也稱為DNA酶)核苷酸序列或其衍生蛋白來修飾細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的方法，其中TAL效應(yīng)子核酸酶將結(jié)合至并且將加工所述靶DNA。

該方法還將包括以下步驟：向細(xì)胞提供包含與至少部分靶標(biāo)DNA序列同源的序列的核酸序列，從而可以在布置在感興趣的基因序列之間的靶序列部分和其相應(yīng)的核酸部分之間發(fā)生同源重組。

可以通過使用包含編碼TALEN蛋白質(zhì)的序列的一種或多種載體或者通過機(jī)械注射、通過細(xì)菌分泌系統(tǒng)或者通過電穿孔直接將相應(yīng)衍生蛋白引入細(xì)胞來獲得細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

通過使用轉(zhuǎn)錄激活子樣蛋白，具體地II類限制核酸內(nèi)切酶(如FokI)，該方法已用于多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

然而，在植物遺傳學(xué)領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)化方法復(fù)雜、不總有效且費(fèi)時(shí)。對(duì)于一些植物品種，如甜菜細(xì)胞和難以遺傳轉(zhuǎn)化的植物，這是特別真實(shí)的。

因此，明確需要針對(duì)轉(zhuǎn)化的遺傳方法的改善，特別是甜菜植物的基因靶向。

因此，本發(fā)明旨在提供用于甜菜細(xì)胞和植物基因靶向的新方法和工具，其允許甜菜原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化，具體地，其基因靶向和編輯。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及甜菜原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

-從分離自甜菜(Beta vulgaris)植物的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞獲得原生質(zhì)體，

-用包含感興趣的核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)或者包含編碼這些轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)序列的序列的一個(gè)或多個(gè)載體的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化這些原生質(zhì)體，其中這些轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶靶向并處理原生質(zhì)體的靶(DNA)序列，并通過用包含感興趣的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體同源重組來替換該靶(DNA)序列，

-可能地，向這些原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)應(yīng)用對(duì)所述原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)有毒的，優(yōu)選地致死的培養(yǎng)基(如一種或多種除草劑)，和

-從細(xì)胞培養(yǎng)再生甜菜植物，優(yōu)選地，從整合了包含感興趣的序列的核酸構(gòu)建體的存活的原生質(zhì)體再生甜菜植物，所述感興趣的序列可能使所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)所應(yīng)用的培養(yǎng)基(如一種或多種除草劑)的毒性，優(yōu)選地致死活性具有耐受性。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，所述核酸構(gòu)建體還包含用于感興趣的核苷酸序列在甜菜原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織(愈傷組織)和/或植物中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，應(yīng)用于原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基包含一種或多種ALS抑制劑(除草劑)，其選自由以下各項(xiàng)組成的組：磺酰脲除草劑、磺酰氨基羰基三唑啉酮除草劑、咪唑啉酮除草劑、三唑并嘧啶除草劑、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯除草劑或它們的混合物。