[發明專利]生產具有改性糖基化重組糖蛋白的方法

有效

• 申請號: 201580022914.0
• 申請日: 2015-03-17
• 公開（公告）號: CN106715686B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 陳念宜;吳哲豪;陳虹琦;湯竣鈞
• 申請（專利權）人: 合一生技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/56;C12N15/85;C12P21/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

基因工程宿主動物細胞能夠生產具有改性糖基化模式，例如去巖藻糖基化和/或單糖基化的糖蛋白。這種宿主動物細胞可以被工程化以表達巖藻糖苷酶，糖苷內切酶或兩者。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2014年3月17日提交的美國臨時申請號61/954,337的權益，其全部內容以引用方式并入本文中。

背景技術

糖基化(glycosylation)對糖蛋白的結構和功能至關重要。例如，認為糖基化可影響蛋白折疊(及由此的穩定性)和/或糖蛋白的生物活性。治療性重組糖蛋白的需求，特別是單克隆抗體，在最近的二十年強勁增長。以前的研究顯示，重組糖蛋白聚糖結構的微小差異可能影響糖蛋白的生物活性和藥代動力學。例如，阿法達貝泊汀是具有兩個額外的N-連接糖基化位點的重組人紅細胞生成素(EPO)的高度糖基化的類似物。與內源或重組EPO相比，額外糖基化增加了糖類分子質量百分比，并且顯著延長了阿法達貝泊汀的血清半衰期。此外，對于治療性抗體，其功效主要依賴于抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，去除Fc部分的核心巖藻糖殘基的化學-酶促和遺傳方法已被開發，以增加由所述抗體誘導的ADCC效應的效力。

但是，目前可用的用于糖基化重塑的方法通常需要多種酶和/或多個步驟，導致制造糖工程化的重組蛋白成本高。

發明內容

本發明是基于基因工程宿主動物細胞的開發，其能夠生產糖蛋白，如具有包括去巖藻糖基化和單糖基化的改性糖基化的抗體。這樣的宿主動物細胞被工程化以過量表達一種或多種巖藻糖苷酶、糖苷內切酶或二者。出乎意料的是，宿主動物細胞的細胞糖基化機制的改變沒有導致與糖蛋白的合成和宿主細胞的生長相關的不利影響。

因此，本發明提供一種基因工程宿主動物細胞(例如，哺乳動物細胞)，其過量表達巖藻糖苷酶，糖苷內切酶或二者，其中與野生型對應物相比，所述宿主動物細胞生產具有改性糖基化的糖蛋白。在一些實例中，巖藻糖苷酶可以是哺乳動物巖藻糖苷酶或細菌巖藻糖苷酶，例如，人FUCA1，人FUCA2，灰倉鼠(Cricetulus griseus)巖藻糖苷酶，α-L-1腦膜膿毒性金黃桿菌(Chryseobacterium meningosepticum),α-1,6-巖藻糖苷酶或細菌巖藻糖苷酶BF3242。可替代地或另外地，糖苷內切酶可以是Endo S酶，例如，包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的酶。在一些實例中，基因工程化宿主動物細胞表達(i)人FUCA1，人FUCA2，灰倉鼠巖藻糖苷酶α-L-1,腦膜膿毒性金黃桿菌α-1,6-巖藻糖苷酶或細菌巖藻糖苷酶BF3242，和(ii)Endo S(如SEQ ID NO：11)。

本文中所描述的基因工程宿主動物細胞可以進一步表達糖蛋白，所述糖蛋白可以是外源性的(在相同類型的天然動物細胞中不表達)。實例包括：但不限于抗體、Fc融合蛋白、細胞因子、激素、生長因子或酶。

在一些實例中，基因工程宿主動物細胞是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，大鼠骨髓瘤細胞，幼倉鼠腎(BHK)細胞，雜交瘤細胞，拿馬瓦(Namalwa)細胞，胚胎干細胞或受精卵。

本文還描述了用于生產具有改性糖基化模式(例如，去巖藻糖基化或單糖基化)的糖蛋白的方法，所述方法使用任何本文所述的基因工程宿主動物細胞。所述方法可以包括(i)提供表達(a)糖蛋白和(b)巖藻糖苷酶、糖苷內切酶或二者的宿主動物細胞；在允許用于生產糖蛋白和巖藻糖苷酶、糖苷內切酶或二者的條件下，培養所述宿主動物細胞；(ⅱ)收集所述宿主動物細胞或培養上清液以便分離糖蛋白，和任選地(iii)分離所述糖蛋白。所述方法可以進一步包括(ⅳ)分析所述糖蛋白的糖基化模式。

此外，本發明特征在于一種用于制備本文描述的任一基因工程動物細胞的方法。所述方法可以包括：(i)將一種或多種表達載體引入動物細胞，所述表達載體共同地編碼巖藻糖苷酶、糖苷內切酶或二者，以及任選地(ii)將編碼糖蛋白的表達載體引入所述動物細胞。所述方法可以進一步包括分選表達巖藻糖苷酶、糖苷內切酶、和糖蛋白的轉化細胞。