[發(fā)明專利]檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201511033981.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN105420414B
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹永長(zhǎng);薛春宜;李杰;何亮亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京市盈科律師事務(wù)所 11344
• 代理人: 馬麗麗

本發(fā)明公開了檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物及方法。所述引物包括第一對(duì)引物和第二對(duì)引物，其序列與LMAN2基因3’非翻譯區(qū)中的兩對(duì)序列或其互補(bǔ)序列相同。所述方法包括以下步驟：提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板，使用第一對(duì)引物qPCR擴(kuò)增common區(qū)域的Proximal片段，得到CT值_pro；以cDNA為模板，使用第二對(duì)引物擴(kuò)增Extended區(qū)域的Distal片段，得到CT值_dis；計(jì)算CT值_dis與CT值_pro的比值。本發(fā)明LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的檢測(cè)方法方便快捷，適合在條件簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室以及發(fā)展中國(guó)家得到進(jìn)一步推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物及方法。

背景技術(shù)

馬立克氏病(Marek's disease,MD)是由馬立克氏病病毒((Marek's diseasevirus,MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病，主要危害雞，鶴鶉、山雞也有發(fā)病。該病可引起內(nèi)臟器官、肌肉和外周神經(jīng)的淋巴細(xì)胞瘤的神經(jīng)腫大。臨床上MD發(fā)病雞群表現(xiàn)為生長(zhǎng)不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見的病變是神經(jīng)損害和多種實(shí)質(zhì)臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見，因神經(jīng)損害導(dǎo)致的不對(duì)稱性進(jìn)行性麻痹，最終可引起單個(gè)或多個(gè)肢體的完全性麻痹。

MDV屬于皰疹病毒科，有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含有特異性抗原。Ⅰ型MDV感染能引起腫瘤，Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株無(wú)致病性，可用于疫苗株。因Ⅰ型MDV感染可引起腫瘤，其檢測(cè)具有非常重要的意義。目前，臨床上最常用鑒別診斷Ⅰ型MDV感染的方法是病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)方法等。病毒分離鑒定不但對(duì)臨床診斷很有價(jià)值，對(duì)流行病學(xué)及病原學(xué)研究亦至關(guān)重要，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約需1～2個(gè)月，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的操作要求高，局限性較大。血清學(xué)方法如ELISA等主要用于檢測(cè)羽毛囊上皮、溶細(xì)胞感染的淋巴細(xì)胞組織及細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品，此類方法檢測(cè)成本相對(duì)較高，并且由于部分病例中病毒血癥時(shí)間較短，病毒含量低，導(dǎo)致檢出率較低。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)馬立克氏病病毒存在的問(wèn)題，提供檢測(cè)LMAN2(lectin,mannose-binding 2,LMAN2)基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物及方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物，所述引物包括第一對(duì)引物和第二對(duì)引物，其序列與LMAN2基因3’非翻譯區(qū)中的兩對(duì)序列或其互補(bǔ)序列相同。

優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的序列與LMAN2基因3’非翻譯區(qū)中common區(qū)域的部分序列或其互補(bǔ)序列相同，所述第二對(duì)引物的序列為L(zhǎng)MAN2基因3’非翻譯區(qū)中Extended區(qū)域的部分序列或其互補(bǔ)序列相同。

優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物用于擴(kuò)增common區(qū)域的Proximal片段，所述第二對(duì)引物用于擴(kuò)增Extended區(qū)域的Distal片段。

優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的序列如SEQ ID NO：1-2所示或其互補(bǔ)序列，所述第二對(duì)引物的序列如SEQ ID NO：3-4所示或其互補(bǔ)序列。

一種檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的方法，包括以下步驟：

提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

以cDNA為模板，使用第一對(duì)引物qPCR擴(kuò)增common區(qū)域的Proximal片段，得到CT值_pro；

以cDNA為模板，使用第二對(duì)引物擴(kuò)增Extended區(qū)域的Distal片段，得到CT值_dis；