[發(fā)明專利]一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201511029576.1
• 申請(qǐng)日: 2015-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105463008B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹廣麗;王震宇;楊謙;傅德峰;叢華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12R1/085
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、提取釀酒酵母(S.cerevisiae)的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)苯丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因設(shè)計(jì)引物aroF/R和adhF/R，然后PCR得到苯丙酮酸脫羧酶基因aro10和乙醇脫氫酶基因adh2；

二、將苯丙酮酸脫羧酶基因aro10和乙醇脫氫酶基因adh2利用引物aroF和adhR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并插入BamH I、BglII、Xho I和Nhe I四個(gè)酶切位點(diǎn)，連接形成融合片段BamHI–BglII–aro10–Xho I–adh2–Nhe I，然后用BamH I和Nhe I對(duì)上述融合片段進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pMA5進(jìn)行雙酶切；將雙酶切后的苯丙酮酸脫羧酶基因aro10和乙醇脫氫酶基因adh2的融合片段與雙酶切后的表達(dá)載體pMA5連接，再熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10菌株中，鑒定正確后，獲得重組質(zhì)粒pMA5-RD；

三、根據(jù)蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)全基因組序列，設(shè)計(jì)引物alsF/alsR，然后以蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)全基因組DNA為模板擴(kuò)增得到兩端含有酶切位點(diǎn)BamH I/Bgl II的alsS基因片段，并通過(guò)BamH I和Bgl II分別酶切alsS基因片段和步驟二得到的重組質(zhì)粒pMA5-RD，然后將酶切后的alsS基因片段與重組質(zhì)粒pMA5-RD連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMA5-SRD；將表達(dá)質(zhì)粒pMA5-SRD電擊轉(zhuǎn)入蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)菌株中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性LB平板進(jìn)行篩選，經(jīng)驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為工程菌株；

四、通過(guò)同源重組法敲除步驟三得到的工程菌株中丙酮酸代謝旁支途徑上的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因pflB及pta，最終得到利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一所述的苯丙酮酸脫羧酶基因的NCBI GeneID：851987。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一所述的乙醇脫氫酶基因的NCBI GeneID：855349。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一和步驟二所述的引物aroF序列為：5'-CGGGATCCCGAAGATCTTCCATGGCACCTTGTACAATTGA-3'；aroR序列為：5'-TGAGTTTCTGGAATAGACATCCGCTCGAGCGGCTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGC-3'；adhF序列為：5'-GCACTTAAAAGAAATAAAAAATAGCCGCTCGAGCGGATGTCTATTCCAGAAACTCA-3'；adhR序列為：5'-CTAGCTAGCTTATTTAGAAGTGTCAACAAC-3'。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三所述的引物alsF序列為：5'-CGCGGATCCCACACATGATTAGTTTGAGTACAGGTG-3'；alsR序列為：5'-GGAAGATCTCTGCCTCCATTAGTTTAATTG-3'。