[發明專利]一種適用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法

在審

• 申請號: 201511026270.0
• 申請日: 2015-12-31
• 公開（公告）號: CN105603047A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 周會娜;陳霞;翟妞;劉萍萍;陳千思;鄭慶霞;張慧;徐國云;林福呈
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 鄭園;張真真

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法。

背景技術

谷胱甘肽轉移酶(GSTs)具有多種催化活性：可以將還原型谷胱甘肽(GSH)共價偶聯到含有親電子碳、氮、硫原子的非極性化合物上，從而使GSTs做為中心元件參與到藥物、農藥及其它異源物質的代謝去毒過程；GSTs還可以催化還原一些氧化脅迫的代謝產物，如過氧化物等，從而使得GSTs在防御病菌侵染和非生物脅迫中發揮重要的作用。因此，在很多植物研究中都將GSTs活性作為一個重要指標來評價植株的生長狀態和脅迫反應特性。

GSTs活性的分析方法以CDNB偶聯活性的分析為主，目前文獻上的一些方法在CDNB和GSH使用量上的差異較大，且CDNB多是溶于乙醇或乙醇/水溶液中。事實上CDNB在乙醇中的溶解度較低，更難溶于乙醇/水溶液中，因此有些文獻中CDNB的使用量實際上是較難達到的，且乙醇加多會引起蛋白變性；另外高CDNB和GSH含量時本底反應較高，會掩蓋酶催化反應；還有一些方法需要對全蛋白提取液進行進一步的操作以提高GSTs的蛋白含量。這些方法在實驗中的實際操作性較低。本發明在現有分析方法的基礎上，通過反復實驗，確定了一個適用于植物全蛋白提取液的CDNB偶聯活性分析方法。

發明內容

本發明提供的一種適用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，該方法通過反復實驗，選擇適用于植物全蛋白提取液的CDNB偶聯活性分析方法實現的。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種適用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，以煙草葉片或根的全蛋白提取液為樣品，同時以提取液為對照樣，以GSH和CDNB為反應底物，通過測定GS-CDNB偶聯產物的量分析GSTs的活性。

所述全蛋白提取液為非變性提取液。

所述GSTs活性分析方法的反應體系，按順序在一個比色皿中依次加入50～200μl提取的全蛋白、1～4μlGSH和0.1～0.4μlCDNB，并加入緩沖液至100～400μl。

所述CDNB用丙酮溶解，濃度為0.1-1.5M。

所述反應體系中GSH與CDNB的摩爾濃度比大于2。

所述GSH用全蛋提取液溶解，濃度為40mM-200mM。

所述植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法，作為篩選高GSTs活性優良植株、除草劑的應用。

本發明的有益效果：改進后的方法將CDNB的溶劑由乙醇改為丙酮，大大提高了CDNB的溶解性，在同樣CDNB濃度下降低了溶劑的使用量，從而避免了由過量溶劑引起的蛋白變性；同時，改進后的方法增加了谷胱甘肽(GSH)與CDNB的摩爾比，使其更有利于分析GSTs蛋白含量較低的植物全蛋白提取液。

附圖說明

圖1為煙草幼苗根和葉片的GSTs活性；

圖2為不同品種玉米葉片的GSTs活性；

圖3為不同品種玉米根的GSTs活性；

圖4為不同農藥對煙草根中GSTs活性的影響；

圖5為不同農藥對煙草葉片中GSTs活性的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件。

實施例1

比較煙草根和葉片GSTs活性分析方法的應用

試劑的配制：稱取0.20255克CDNB(分子量為202.55)溶于1ml丙酮，配成1MCDNB溶液，凍存于-20℃；稱取0.61466克還原型谷胱甘肽(GSH，分子量為307.33)溶于10ml提取液中，配成200mMGSH溶液，每份1ml凍存于-20℃，用前取出一份于冰上融化。

材料的準備：以生長至6葉齡的煙草葉片和根為材料，采集完全展開的第三、四位葉片，稱重后使用；用清水洗凈根部的土壤，濾紙吸干水分，稱重待用。

全蛋白提取液(粗提液)的制備：使用pH為7.5的磷酸緩沖液(不含尿素)按照1：3(w/v)的比例加入煙草葉片或根中，冰浴研磨至勻漿，14000×g、4℃離心15min，上清即為煙草葉片或根的全蛋白粗提液，冰浴放置。