[發明專利]一種快速檢測痰液中結核分支桿菌的試劑盒

在審

• 申請號: 201511026218.5
• 申請日: 2015-12-31
• 公開（公告）號: CN105524988A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 遲大利;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測痰液中結核分枝桿菌的探針，其特征在于：所述探針為分子信標探針， 該分子信標探針由莖環結構兩部分組成，總長度25~50個堿基，其中中間的環序列部分與細 菌中核糖體RNA（16srRNA、23srRNA等）序列相匹配，兩端莖序列部分為5~10個堿基互補的 DNA序列，分子信標探針的5'-端用熒光基團標記，3'-端用熒光淬滅基團標記，在常溫、游離 狀態下分子信標探針可自動退火形成發夾結構，熒光基團與熒光淬滅基團由于距離較近而 不發出熒光信號，只有當分子信標探針中環序列部分與靶序列特異性結合之后，熒光基團 與熒光淬滅基團彼此分離，進而發出熒光信號；所述探針是通過核酸雜交的原理檢測痰液 中的結核分枝桿菌，

結核分枝桿菌分子信標探針序列〈SEQIDNo.1〉為：

5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’。

2.一種用于檢測痰液中結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

（1）權利要求1所述的探針；

（2）液化液；

（3）裂解液；

（4）終止液；

（5）固定液。

3.根據權利要求2所述的用于檢測痰液中結核分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，所述液 化液包括：1%(w/v)PEG，0.6mMDTT，13.4mMNaCl，0.3mMKCl，1mMNaH₂PO₄，0.1mM KH₂PO₄，50mMEDTA，0.1%(v/v)TritonX-100，50mMTrisHClpH8.0；

所述裂解液包括：5M鹽酸胍，0.2mMDTT，50mMEDTA，0.5%(w/v)過硫酸銨，0.1%(v/ v)TritonX-100，10mMTrisHClpH7.0；

所述終止液包括50mMTrisHClpH10.0，0.5MNaCl，0.1%(v/v)NP-40，0.5%(v/v) TritonX-100；

所述固定液包括：5%(w/v)甘油，0.2mMDTT，25mMNaCl，0.3mMKCl，0.6mM NaH₂PO₄，0.6mMKH₂PO₄，50mMEDTA，10mMTrisHClpH7.0。

4.一種采用如權利要求3所述試劑盒的用于檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的方法，其 特征在于，所述方法包括以下步驟：

(a)取待檢痰液樣本，加入到液化液中，樣本與所述液化液的體積比為1:1~1:10，震蕩 混勻；

(b)取按步驟(a)操作獲得的液體5~10ul滴至載玻片上，50~65℃烘干5~10min；

(c)將按步驟(b)操作獲得的載玻片浸入乙醇中5~10min，50~65℃烘干5~10min；

(d)在按步驟(c)操作獲得的載玻片加樣孔中加入探針5~10ul，置于加熱板中50~65℃ 避光烘干5~10min；

(e)將按步驟(d)操作獲得的載玻片浸入終止液中1~60sec，置于加熱板中50~65℃烘 干5~10min；

(f)在按步驟(e)操作獲得的載玻片加樣孔中加入固定液5~20ul，加蓋蓋玻片，用熒光 顯微鏡鏡檢觀察，用10×物鏡觀察計數，用40×或100×物鏡觀察細菌形態；

(d)在按步驟(c)操作獲得的載玻片加樣孔中加入探針5~10ul，置于加熱板中50~65℃ 避光烘干5~10min；

(e)將按步驟(d)操作獲得的載玻片浸入終止液中1~60sec，置于加熱板中50~65℃烘 干5~10min；

(f)在按步驟(e)操作獲得的載玻片加樣孔中加入固定液5~20ul，加蓋蓋玻片，用熒光 顯微鏡鏡檢觀察，用10×物鏡觀察計數，用40×或100×物鏡觀察細菌形態。