[發(fā)明專利]酵母融合菌混菌劑及其液體菌劑的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201511025145.8
• 申請(qǐng)日: 2015-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN105483047A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫榮高;代積文;代鳳雷;曾學(xué)平;高小青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅長(zhǎng)業(yè)生態(tài)生物科技集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N1/19;C12N1/14;C12N1/02;C12N13/00;C12N15/04;C12R1/865;C12R1/74;C12R1/645;C12R1/10;C12R1/23;C12R1/065;C12R1/845
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種酵母融合菌混菌劑，其特征在于包括有酵母融合菌(FusantbetweenCandida tropicalisandSaccharmycescevisiae)F105，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心保藏，保藏時(shí)間為2014年12月30日，保藏編號(hào)為CGMCCNO.10263；地衣芽孢 桿菌(BacillusLicheniformis)B-36購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心編號(hào)為Accc11080； 圓褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN-09，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年4月26日，保藏編號(hào)為CGMCCNO.3768；根霉 菌(Rhizopus)R和嗜酸乳桿菌(LactobaciLLus-acidophilum)L兩菌種均為市場(chǎng)公開銷 售菌種，其中所述酵母融合菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25-40％，地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)為 總活菌數(shù)的15-30％，圓褐固氮菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30％，根霉菌的活菌數(shù)為總 活菌數(shù)的15-30％，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-35％。

2.如權(quán)利要求1所述的酵母融合菌混菌劑，其特征在于還包括有發(fā)酵淀粉廢水為玉 米、豆類、小麥、大麥、薯類農(nóng)產(chǎn)品加工生產(chǎn)淀粉時(shí)所產(chǎn)生的廢水或豆腐廢水或粉絲廢 水或玉米淀粉廢水或馬鈴薯淀粉廢水，廢水有機(jī)物COD_cr為10000—50000mg/L。

3.如權(quán)利要求1所述的酵母融合菌混菌劑，其特征在于所述的酵母融合菌的制備有 如下步驟：將酒精酵母菌作母種的斜面菌轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)，在液體振蕩培養(yǎng)14小時(shí)后，用 EDTA-巰基乙醇進(jìn)行預(yù)處理，使用1％的纖維素酶和1％蝸牛酶進(jìn)行酶解脫壁，時(shí)間為2 小時(shí)，溫度33℃，得到酒精酵母原生質(zhì)體；將熱帶假絲酵母菌作母種的斜面菌轉(zhuǎn)種和培 養(yǎng)，在液體振蕩培養(yǎng)14小時(shí)后，用EDTA-巰基乙醇進(jìn)行預(yù)處理，使用1.5％的纖維素酶 和0.5％蝸牛酶進(jìn)行酶解脫壁，時(shí)間為2.5小時(shí)，溫度33℃，得到熱帶假絲酵母原生質(zhì)體； 將熱帶假絲酵母原生質(zhì)體經(jīng)0.1％碘乙酸滅活，與酒精酵母原生質(zhì)體以1:1混合，將沉淀 懸于35％聚乙二醇的促溶劑中，30℃水浴靜止處理，pH6.0，時(shí)間為40min，融合菌液經(jīng) 高滲磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，涂布于高滲基礎(chǔ)培養(yǎng)基和高滲完全培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，經(jīng) 30℃、7天培養(yǎng)，平板生長(zhǎng)出酵母融合菌。

4.如權(quán)利要求1所述的酵母融合菌混菌劑，其特征在于所述的圓褐固氮菌的制備有如 下步驟：

(1)采樣：圓褐固氮菌是從蘭州市南北兩區(qū)地區(qū)的暗灰鈣土，淡灰鈣土，紅泥土和堿 土的四種不同土壤類型和多個(gè)植物根區(qū)的0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤深度的266份土 樣；

(2)分離培養(yǎng)：取10g新鮮土樣加入盛有100ml無(wú)菌水的500ml三角燒瓶中，放搖床 上振蕩10min使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，吸取1ml上清液加到9ml無(wú)菌 水中，按10倍法依次稀釋至10^-4-10^-6，各重復(fù)四次；在已滅菌的培養(yǎng)皿中傾注15-20ml阿 須貝(Ashby)的固體瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后用移液槍吸取100ul土壤稀釋液加到培養(yǎng)基表 面，然后立即用涂布棒將稀釋液涂抹均勻；用相同的方法將樣本不同稀釋度的稀釋液從高 稀釋度到低稀釋度依法涂抹；將接種稀釋的培養(yǎng)皿倒置放在28-32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3d 后取出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圓褐固氮菌菌落，轉(zhuǎn)種在阿須貝 瓊脂斜面試管培養(yǎng)基上，經(jīng)28-32℃恒溫培養(yǎng)2-3d，取出后即為圓褐固氮菌母鐘，保存在 4-8℃冰箱內(nèi)備用；

(3)誘變：將母種再經(jīng)紫外線(30s)，亞硝基胍(NTG)誘變處理以及生化形態(tài)學(xué)鑒 定，最后鑒定獲得的菌種轉(zhuǎn)種于阿須貝瓊脂斜面試管培養(yǎng)基上，即得保藏菌種。

5.一種酵母融合菌混菌液體菌劑的制備方法，其特征在于有如下步驟：

A.瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備及菌種的培養(yǎng)：

a.酵母融合菌酵母膏瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備：

酵母膏0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、瓊脂粉1-3％、無(wú)菌水80-120ml， 加熱溶解后用1％的氫氧化鈉調(diào)pH值至5.5-6.5，經(jīng)110-114℃，30-35分鐘蒸汽滅菌，

然后在無(wú)菌條件下分裝于15*1.5cm的干燥滅菌的試管擺成斜面待凝固后備用；

b.地衣芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)牛肉膏瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備：

蛋白胨含量重量百分比為0.25-1％，氯化鈉的含量重量百分比為0.25-1％，牛肉膏 的含量重量百分比為0.2-0.5％，瓊脂粉的含量重量百分比為1-3％，其余為無(wú)菌水，該培 養(yǎng)基的PH為6.5-7.5；

c.圓褐固氮菌阿須貝(Ashby)瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備：

甘露醇的含量重量百分比為0.8-1.2％，碳酸鈣的含量重量百分比為0.2-0.8％，磷 酸二氫鉀的含量重量百分比為0.01-0.03％，硫酸鎂(含七個(gè)結(jié)晶水)的含量重量百分比 為0.01-0.03％，氯化鈉的含量重量百分比為0.01-0.03％，硫酸鈣(含兩個(gè)結(jié)晶水)的含 量重量百分比為0.005-0.015％，瓊脂粉的含量重量百分比為1-3％，其余為無(wú)菌水，所述 培養(yǎng)基的PH為6.8-7.0；

d.根霉菌馬鈴薯-蔗糖(PDA)瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備：

馬鈴薯的含量重量百分比為15-25％，蔗糖的含量重量百分比為1.5-2.5％，瓊脂粉 的含量重量百分比為1-3％，其余為無(wú)菌水，所述培養(yǎng)基的PH為5.5-6.5；

e嗜酸乳桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)的制備：

番茄酵母吐溫-80醋酸鹽培養(yǎng)基：蛋白胨的含量重量百分比0.8-1.2，牛肉膏的含 量重量百分比0.8-1.2，葡萄糖的含量重量百分比0.8-1.2，酵母膏的含量重量百分比 0.8-1.2，番茄汁的加量重量百分比15-20毫升，吐溫-80的含量重量百分比0.03-0.07 毫升，瓊脂含量重量百分比1.8-2.2，另加醋酸緩沖液(PH5.4)含量重量百分比 0.03-0.06mol,分別用58.84Kpa，15分鐘滅菌，用時(shí)混合；

對(duì)以上酵母融合菌，地衣芽孢桿菌，圓褐固氮菌，根霉菌和嗜酸乳桿菌五種菌，分 別取母鐘轉(zhuǎn)種各自制備的瓊脂試管斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)為一級(jí)菌種；

B液體培養(yǎng)基及液體菌種的制備

a液體培養(yǎng)基的制備：在一升新鮮豆腐廢水或粉絲廢水或玉米淀粉廢水或馬鈴薯淀 粉廢水中加入紅糖1-2g，硫酸銨1-2g，碳酸鈣1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％石灰水調(diào) PH6.2-7.5,分裝于500ml三角燒瓶中，分裝量為瓶子容量的1/4，然后經(jīng)110-112℃，30-35 分鐘高壓滅菌，冷卻后備用；

b分別取酵母融合菌、地衣芽孢桿菌、圓褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳桿菌的一級(jí)菌 種，在無(wú)菌條件下分別轉(zhuǎn)種于液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)28-32℃，24-72h靜置培養(yǎng)。 其培養(yǎng)菌液為二級(jí)菌種；

c分別將酵母融合菌、地衣芽孢桿菌、圓褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳桿菌的二級(jí)菌 種，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)種于液體三角燒瓶培養(yǎng)基中，上搖床進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，振幅100-120 轉(zhuǎn)/分鐘，溫度28-32℃時(shí)間24-72h，其培養(yǎng)液為三級(jí)菌種，根據(jù)需要繼續(xù)可逐級(jí)擴(kuò)大培 養(yǎng)；

d分別將重量百分比為酵母融合菌為25-40％、地衣芽孢桿菌15-30％、圓褐固氮菌 15-30％、根霉菌15-30％、嗜酸乳桿菌15-30％的三級(jí)菌種再擴(kuò)大培養(yǎng)，五種液體菌同時(shí)轉(zhuǎn) 種在同一發(fā)酵罐中經(jīng)28-32℃，18-24h通氣攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液為酵母融合菌混菌 劑。