[發明專利]一種高產核黃素大腸桿菌工程菌株及構建及發酵方法

有效

• 申請號: 201511014766.6
• 申請日: 2015-12-29
• 公開（公告）號: CN105483071B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 陳濤;劉雙;康培;王智文;趙學明
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P25/00;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種高產核黃素大腸桿菌工程菌株及構建及發酵方法，構建方法為：(1)獲得rib‐int段：(2)構建pLR 01質粒：(3)構建EC?rib 01菌株：(4)構建EC?Rib 02菌株：敲除步驟(3)所獲得的菌株EC?Rib 01基因組的糖酵解途徑中的pfkA基因和ED途徑中的edd基因及eda基因，得到菌株命名為EC?Rib 02。本發明的一種高產核黃素大腸桿菌工程菌株EC?Rib 02核黃素產量達到10.47g/L以上，是目前大腸桿菌生產核黃素的最高產量；本發明的EC?Rib 02菌株的生產周期為60?80h，比現有常用的核黃素工程菌株生產周期短，節省能源。

技術領域

本發明屬于生物工程技術與應用和發酵工程領域，具體地涉及一種生產核黃素的大腸桿菌菌株及構建方法及發酵技術。

背景技術

核黃素，又稱維生素B₂，是一種黃色的天然水溶性B族維生素。其分子式為C₁₇H₂₀O₆N₄，分子量為376，是人體必需的13種維生素之一。核黃素是機體內許多酶系統的重要輔基－黃素腺嘌呤二核甘酸(FAD)與黃素單核甘酸(FMN)的合成的前體物質。作為黃素蛋白的輔酶參與傳遞氫的有關代謝，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用，是生命活動中不可缺少的維生素，是維持人和動物機體正常物質代謝所必須的營養物質。

核黃素已經廣泛用于飼料、食品和醫藥領域。核黃素能促進蛋白質、脂肪、碳水化合物的代謝，具有維護皮膚和粘膜的生理功能。若機體缺乏核黃素，就會影響生物氧化作用，引起物質代謝紊亂，出現一系列病癥，嚴重時會引起死亡。它作為常用臨床藥物，用于輔助治療口角炎、眼角膜炎、白內障、眼角膜及口角血管增生等多種疾病。

核黃素主要生產方法為化學半合成法和微生物發酵法，其中，半合成法生產核黃素以D‐核糖為原料，純度較高，但得率只有60％左右，原料浪費較大，而微生物發酵法生產核黃素則具有生產工藝簡單、原料廉價、對環境無污染等優點，且只需要一步，目前已成為核黃素生產的主要方法。

用于核黃素發酵生產的菌株主要有酵母和基因工程菌兩大類。1940年，利用阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)發酵生產核黃素首次獲得了成功，產量為500微克/毫升；1946年，利用棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)也實現了在發酵液中積累少量的核黃素；1947年，以碎麥芽或乳清為原料，丙酮丁醇梭狀桿菌(Clostridium acetobutylicum)發酵法被首次應用于商業化生產核黃素。利用真菌進行核黃素生產存在著諸如發酵周期過長、原料成分配比復雜、需加入不飽和脂肪酸來促進核黃素的產量等缺點。隨著基因工程技術的發展，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和產氨棒狀桿菌(Corynebactia aminogensis)等產核黃素工程菌相繼構建成功，這些工程菌具有發酵周期短(2～3天)、原料要求簡單、產量高等優點，在核黃素的微生物發酵生產中顯示了強大的生命力。特別是相繼構建成功的Bacillus subtilis等產核黃素工程菌，最高報道在三天時間內可達到20～27g/L。

目前生產上應用的產核黃素枯草芽孢桿菌多為通過多輪理化誘變之后篩選到的，由于隨機誘變引入突變點的不確定性，這些生產菌株往往具有比較復雜的遺傳背景，使得通過代謝工程進一步合理改進這些工業菌株面臨著較大的挑戰和困難。同時，大量未知突變的存在也使得對進一步合理改進的解釋和評估變得更為復雜了。另外，由于誘變的隨機性，這些高產菌株在逐漸積累和目標產品高產相關的正突變的過程中也不可避免的積累了一些不利突變點以及一些與目標表型無關的突變點。同野生菌株相比，它們大都在菌體生長速度、底物利用種類、對不利環境的耐受性或遺傳穩定性等方面存在缺陷。由于和這些不良性狀相關的基因型通常非常復雜，通過代謝工程方法消除這些不良性狀也面臨著很大的困難。

大腸桿菌作為一種重要的模式菌株，對其生理生化特性及遺傳背景已經有了比較深入的了解，相關的分子生物學方法和基因操作技術都比較成熟，有利于通過代謝工程及合成生物學的合理設計來改進菌種。