[發明專利]一種糖原合成酶活性測定試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201511013812.0
• 申請日: 2015-12-31
• 公開（公告）號: CN105441530A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 趙林川
• 申請（專利權）人: 蘇州科銘生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/32
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 夏海天

技術領域

本發明屬于生命科學領域領域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種糖原合成酶活性測定試劑盒及其方法。

背景技術

糖原合成酶（GCS）催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UTP，以α-1，4-糖苷鍵相連延長糖鏈，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，對糖代謝的調節和血糖穩態的維持具有重要作用。

目前市面已有的檢測糖原合成酶的方法為漂洗法和固相濾紙法。這兩種方法是基于UDP¹⁴CG在GS的作用下，合成具有放射性的糖原，采用漂洗或固相濾紙抽濾來分離帶放射性標記的糖原和游離的UDP¹⁴CG，最后用液體閃爍計數儀檢測放射強度的方法。漂洗法需要用大量的70﹪無水乙醇進行漂洗，耗時較長，且容易造成環境污染。固相濾紙法雖然克服了環境污染的缺點，但是仍存在以下幾個缺點：1、糖原合成酶的提取液成分過多，成本較高；2、該方法需要用到放射性標記的UDP¹⁴CG，試劑成本較高；3、分離過程較為繁瑣，耗時較長；4、所用到的設備-液體閃爍計數儀并未在一般實驗室普遍使用。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種糖原合成酶活性測定試劑盒及其方法，可快速準確的計算出糖原合成酶的活性。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

一種糖原合成酶活性測定試劑盒，包括以下試劑：

提取液，1瓶，4℃保存，由Tris-HCl緩沖溶液組成，置于60mL試劑瓶中；

試劑一，液體×1瓶，4℃保存，由Tris、氯化鎂、氯化鉀、氫氧化鉀、鹽酸溶于蒸餾水后配制而成，置于50mL試劑瓶中；

試劑二，液體×1瓶，4℃保存，由Tris、氯化鎂、EDTA、巰基乙醇、鹽酸溶于蒸餾水后配制而成，置于5mL試劑瓶中；

試劑三：液體×1支，4℃保存，由乳酸脫氫酶組成，置于1.5mL離心管中；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；由磷酸烯醇式丙酮酸、NADH和丙酮酸激酶組成，置于1.5mL離心管中；

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；由糖原、UDPG、6-磷酸葡萄糖組成，置于5mL試劑瓶中。

進一步的，所述提取液中，Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50mmol/L，pH=7.4，體積為60mL；

進一步的，所述試劑一中，Tris的質量為0.425g，氯化鎂的質量為0.132g，氯化鉀的質量為0.225g，氫氧化鉀的質量為24.3mg，鹽酸的體積為0.261mL，蒸餾水的體積為45mL；

進一步的，所述試劑二中，Tris的質量為30.25mg，氯化鎂的質量為12.2mg，EDTA的質量為1.5mg，巰基乙醇的體積為1uL，鹽酸的體積為9.5uL，蒸餾水的體積為5mL；

進一步的，所述試劑三中，乳酸脫氫酶的體積為41uL；

進一步的，所述試劑四中，磷酸烯醇式丙酮酸的質量為5.8mg，NADH的質量為7mg，丙酮酸激酶的質量為1.35mg；

進一步的，所述試劑五中，糖原的質量為17.5mg，UDPG的質量為1mg，6-磷酸葡萄糖的質量為1.15mg。

糖原合成酶催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UTP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映糖原合成酶活性。

一種基于分光光度法的糖原合成酶活性測定方法，包括以下步驟：

步驟1儀器和用品的準備；

紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水；

步驟2樣本的前處理；

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：（5~10）的比例，進行冰浴勻漿，再采用離心率8000g，在4℃下，離心10min，取上清，置冰上待測；

步驟3分光光度計的預熱；

分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零；

步驟4工作液的配置；

臨用前將所述試劑三和所述試劑四轉移到所述試劑一中，混合溶解待用，現配現用；

步驟5試劑五的配制；

臨用前在所述試劑五瓶中加入2.5mL的所述試劑二，充分溶解待用，現配現用；

步驟6將步驟4中配制的所述工作液和所述試劑五置于37℃預熱5分鐘；