[發明專利]RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育種中的應用

有效

• 申請號: 201511010429.X
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105463014B
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 田莉莉;牛良
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 河南科技通律師事務所 41123
• 代理人: 張曉輝;韓松

本發明屬于生物育種領域，具體涉及一種RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育種中的應用，該表達載體由以下步驟制成：（1）RT?PCR擴增獲得目的基因片段；（2）表達載體的構建。該表達載體在蘋果抗病育種中的應用方法包括以下步驟：（1）將RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體轉入根癌農桿菌；（2）蘋果葉盤受體材料的無菌培養；（3）用農桿菌介導法轉化蘋果獲得轉基因材料；（4）轉基因植株的檢測；（5）對所得轉基因陽性植株進行離體擴繁，移栽，即得。本發明將含有蘋果莖痘病毒外殼蛋白（CP）基因保守片段的RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體遺傳轉化蘋果，獲得的轉基因植株可以獲得抗病毒的特性，在果樹生產中具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物育種領域，具體涉及一種RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育種中的應用。

背景技術

蘋果是我國果樹的主栽樹種之一，栽培面積和產量均居于世界之首。但是，近年來隨著果樹產業的迅速發展和苗木調運的日益頻繁，病毒病的傳播日益嚴重。蘋果莖痘病毒（ASPV）是生產中主要的潛隱性病毒之一，植株受到其侵染后樹勢衰弱，引起產量和果實品質的下降，部分植株表現為葉片反卷、木質部莖痘斑、果實凹陷等，給果樹生產造成嚴重的經濟損失，目前尚無有效的化學防治方法。

近年來，蘋果生產上通常采用的仍是傳統的莖尖脫毒技術，通常包括營養系的初選、試管苗莖尖培養、熱處理脫毒、病毒檢測、無毒苗快繁等幾個步驟。由于自然條件下病毒的遺傳物質RNA極易發生變異，這就使得已有脫毒苗木在栽培過程中難免還會受到病毒的再次侵染，難以做到有效脫毒。

目前，通過基因工程培育抗病毒品種，已成為獲得抗病毒植物最為有效的技術途徑，但目前果樹植物上通常采用的仍是直接利用病毒外殼蛋白基因進行轉化的傳統策略，主要包括以下幾個步驟：（1）RT-PCR擴增獲得病毒基因的完整序列；（2）將目的基因插入表達載體，構建含有目的基因的過表達載體；（3）將過表達載體轉入根癌農桿菌中；（4）用農桿菌介導法轉化植物獲得轉基因植株。該傳統策略操作繁瑣，要求苛刻，安全性尚得不到保證。

RNA干擾（RNAi）是近年來發展起來的一種dsRNA介導的高頻、高效、高度特異的基因沉默技術，可通過將外源dsRNA導入細胞介導同源靶基因mRNA序列的降解，抑制靶基因的表達，是發生在轉錄后的基因沉默現象。RNAi介導的植物抗病毒基因工程的原理是，利用RNAi合成與病毒同源的dsRNA，并將其轉入植物細胞內，由植物體的RNAi機制對入侵病毒的RNA進行特異性切割降解，從而保護植物體不受病毒危害。雖然，通過RNA干擾技術沉默病毒外殼蛋白(CP)基因在某些作物(如大豆、煙草等)上已經獲得了良好的抗病毒效果，由于蘋果為多年生木本植物，與草本植物相比，利用基因工程進行抗病育種技術的發展水平明顯滯后，因此在蘋果上應用障礙較大，長期得不到實施。

發明內容

針對以上問題，本發明提供一種RNAi抗蘋果莖痘病毒表達載體及其在蘋果抗病育種中的應用，獲得的轉基因植株具有抗病毒特性，在果樹生產中具有良好的應用前景。

為解決上述問題，本發明通過以下技術方案實現：

一種抗蘋果莖痘病毒植株的育種方法，包括以下步驟：

（1）RT-PCR擴增獲得目的基因片段：

根據病毒基因全長序列，在保守區段設計合成引物；提取感病材料的植物總RNA，通過反轉錄獲得cDNA第一鏈，并以此為模板、利用所合成引物進行PCR擴增，獲得目的基因片段；將目的基因片段切膠回收，連接至T載體，測序驗證；

優選采用以下步驟：

（1.1）根據Genebank公布的ASPV病毒外殼蛋白基因全長序列，在保守區段設計、合成引物，

ASPV-F：5'-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3，