[發明專利]一種DPYD*9B基因多態性的引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201511010138.0
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105463098A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 胡昌明;梁耀銘;于世輝;趙薇薇;燕啟江;郭周萍
• 申請（專利權）人: 廣州金域檢測科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種DPYD*9B基因多態性的引物及其檢測方法。

背景技術

二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，DPD)編碼基因是位于1號人類染色體的短臂上(1q22)，基因全長約150kb，含有3kb的編碼序列，其由23個外顯子構成，長度從69bp到1404bp，基因中內含子由長短不等的序列組成。二氫嘧啶脫氫酶是作用于5-FU藥物代謝途徑的關鍵酶之一，是分解代謝的限速酶，其含量的高低決定了5-FU藥物的代謝速度，進而影響體內藥物的毒性和療效。

5-Fu及其前體藥物卡培他濱廣泛用于腫瘤化療，80%以上的5-Fu及其前體藥物是通過DPD代謝降解為無活性代謝物二氫氟尿嘧啶(FUH2)而失活。不同個體間DPD酶活性存在明顯差別，導致藥物清除率、腫瘤的反應性及患者的毒性反應存在明顯的個體差異性。

DPYD突變會影響DPD酶活性的改變，中國北方人群的研究發現DPYD*9(外顯子2，T85C)的突變頻率較高(11.25%)。因此，檢測DPYD基因多態性可以對腫瘤患者進行藥物敏感指導，提高治療效果，降低藥物的毒副作用。

中國專利CN102146440B公開了一種甄別DPYD基因*9A突變位點的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物、EvaGreen熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶。該實時熒光PCR檢測方法可以實現二氫嘧啶脫氫酶基因*9A突變位點快速、準確、特異分析。但是，但其高居不下的假陽性率為實際應用所詬病，而且該檢測方法還存在檢測通量少，每次只能檢測一種突變類型的缺陷，不能滿足實際應用的需要。

中國專利CN102952866B公開了一種DPYD基因多態性檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片包括野生型和突變型ASPE引物，每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因多態性位點的特異性引物序列組成。該液相芯片可用于并行或單項檢測DPYD基因三種常見基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突變型。但是，上述檢測方法操作復雜，不利于大規模的推廣和應用。

發明內容

為了解決現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種DPYD*9B基因多態性的引物及其檢測方法，該引物主要用于檢測DPYD基因的DPYD*9B(c.2846A>T)位點，具有特異性強、檢測靈敏度高、準確性好等優點，為DPYD*9B基因多態性提供了一種簡單有效的檢測方法。

本發明提供了一種DPYD*9B基因多態性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR擴增引物為：針對DPYD*9B的上游引物5’-GCTTGCTAAGTAATTCAGTGGCTAT-3’（SEQIDNO.1）和下游引物5’-AGCATTCTAATTCCAGCAGGATTC-3’（SEQIDNO.2）；所述SNaPshotPCR引物為：針對DPYD*9B的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCAAGTTGTGGCTATGATTG-3’（SEQIDNO.3）。

另外，本發明還提供了一種DPYD*9B基因多態性的檢測方法，包括如下步驟：

S1提取DNA樣品；

S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行多重PCR擴增，并對擴增產物進行純化；

S3以步驟S2純化后的PCR擴增產物為模板，采用權利要求1中所述的SNaPshotPCR引物進行SNaPshotPCR擴增，并對SNaPshotPCR擴增產物進行純化；

S4采用毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。

進一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。

進一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應條件包括：階段1：98℃3min；階段2：98℃10s；階段3：58℃30s；階段4：72℃1min；階段5：返回到階段2，29個循環；階段6：72℃5min；階段7：25℃保溫。

進一步地，所述步驟S3中的SNaPshotPCR擴增反應條件包括：階段1：96℃10s；階段2：55℃5s；階段3：60℃30s；階段4：返回到階段1，25個循環；階段5：4℃保溫。

進一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERIDV4.1軟件對檢測結果進行分析。