[發(fā)明專利]一種H7N9禽流感病毒檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201511009939.5
• 申請日: 2015-12-29
• 公開（公告）號: CN105385791A
• 公開（公告）日: 2016-03-09
• 發(fā)明（設計）人: 陳名利;尹煥才;殷建;白鵬利
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種H7N9禽流感病毒檢測試劑盒。更具體地說，本發(fā)明涉及一種基于納米金的H7N9禽流感病毒檢測試劑盒。

背景技術(shù)

H7N9型禽流感是一種新型禽流感，是甲型流感病毒的一種，屬于高致病性禽流感病毒。該病毒于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)，截至2015年01月25日，全國已確診133人，37人死亡，76人痊愈。由于該型禽流感病毒具有高致病性、高死亡率的特點，如何快速有效的檢測、篩查出人是否感染，對病毒的防控具有重要的意義。

目前，H7N9禽流感病毒主要通過核酸檢測來進行，該方法直接檢測病原體核酸，具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優(yōu)點，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。根據(jù)所用設備的不同，實時熒光定量PCR儀進行的RT-PCR可用于定量檢測，普通PCR基因擴增儀可用于定性檢測，另外還有依據(jù)H7N9人感染禽流感的核酸特定序列研制的基于引物和探針的PCR檢測試劑盒。但上述檢測方法均需要專門配備PCR基因擴增儀，檢測成本較高，檢測時間較長。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種H7N9禽流感病毒檢測試劑盒，其僅需配合使用紫外分光光度計，即能快速、高效的檢測出H7N9禽流感病毒，利于對禽流感病毒H7N9亞型及時作出早期診斷、反應和治療。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種H7N9禽流感病毒檢測試劑盒，其用于檢測禽流感病毒中的H7亞型和N9亞型，該試劑盒包括：

第一反應液，其用于檢測H7亞型，其具有0.1mol/L的pH為7.3緩沖液、0.1mol/L的NaCl和修飾有第一單鏈DNA的第一納米金，所述第一單鏈DNA具有摩爾比為1:1的第一上游DNA和第一下游DNA，其中所述第一上游DNA和第一下游DNA不互補，并分別與所述H7亞型中的特征基因序列互補；

第二反應液，其用于檢測N9亞型，其具有0.1mol/L的pH為7.3緩沖液、0.1mol/L的NaCl和修飾有第二單鏈DNA的第二納米金，所述第二單鏈DNA具有摩爾比為1:1的第二上游DNA和第二下游DNA，其中所述第二上游DNA和第二下游DNA不互補，并分別與所述N9亞型中的特征基因序列互補；

其中，所述第一納米金和第二納米金的粒徑范圍均在10～50nm內(nèi)。

在檢測前，首先對待檢樣品進行核酸提取，然后在兩份提取液分別加入所述第一反應液和第二反應液，對H7和N9亞型分別進行檢測。

當?shù)谝环磻杭尤肷鲜鎏崛∫簳r，納米金上修飾的與H7亞型中的特征基因序列互補的單鏈DNA能夠迅速結(jié)合到目標核酸上，引起納米金粒子聚集，從而導致納米金本身紫外光譜的改變，出現(xiàn)新的吸收峰，同時該吸收峰的強度與目標核酸的濃度成正比，該變化能夠通過紫外分光光度計靈敏的檢測出來，從而定性甚至定量H7亞型的含量。同理，當?shù)诙磻杭尤肷鲜鎏崛∫簳r，通過DNA分子的互補雜交也會引起納米金的聚集，使溶液顏色發(fā)生變化，從而定性甚至定量N9亞型的含量。綜合第一反應液液與第二反應液中的檢測結(jié)果，只有在兩份待檢樣品提取液中同時檢測到信號時，才能確認H7N9禽流感病毒的存在。

優(yōu)選的是，其中，所述第一納米金和第二納米金的粒徑相差5～15nm，納米金的尺寸不同，納米金聚集后產(chǎn)生的紫外信號也不同，在分別檢測N7和H9的反應液中，使用不同尺寸的納米金，根據(jù)紫外信號的不同可直接對N7亞型和H9亞型進行區(qū)分，進一步提高了檢測結(jié)果的可辨識性和直觀性。

優(yōu)選的是，其中，所述第一單鏈DNA和第二單鏈DNA的濃度均為0.1～10nmol/L，納米金表面修飾的單鏈DNA的濃度對雜交效率有較大影響，單鏈DNA的濃度過低會降低單鏈DNA中在納米金表面的修飾效果，減低雜交效率，但單鏈DNA的濃度也不能過高，否則較高的空間位阻也會降低雜交效率。

優(yōu)選的是，其中，所述第一單鏈DNA通過巰基修飾于第一納米金，所述第二單鏈DNA通過巰基修飾于第二納米金。

優(yōu)選的是，其中，所述第一納米金與第一單鏈DNA之間還具有3～6個第一保護堿基，所述第二納米金與第二單鏈DNA之間還具有3～6個第二保護堿基，防止由于空間位阻而妨礙單鏈DNA與H7、N9之間的配對雜交，提高檢測的準確性。