[發(fā)明專利]單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201511006904.6
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105641692A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 王一飛;任哲;羅帆;王巧利;廖曉鳳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61P31/20;C12N15/63;C12N7/04
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

1.一種單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗，其特征在于：包含單純皰疹病毒Ⅰ型基 因敲除型病毒株，所述基因敲除型病毒株敲除了單純皰疹病毒Ⅰ型基因組的UL5、UL18、 UL40、UL41、US8、ICP8、ICP34.51和ICP34.52基因中的至少一個。

2.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗，其特征在于：所述基 因敲除型病毒株敲除了單純皰疹病毒Ⅰ型基因組的UL5、UL18、UL41和US8中的至少一個。

3.根據權利要求2所述的單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗，其特征在于：所述基 因敲除型病毒株敲除了單純皰疹病毒Ⅰ型基因組的US8基因。

4.根據權利要求1所述的單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在 于：包括如下步驟：

S1、BAC-HSV-1宿主菌的構建：擴大培養(yǎng)HSV-1病毒，提取HSV-1基因組，并與BAC質粒重 組，構建得到BAC-HSV-1重組質粒，BAC-HSV-1重組質粒電轉化至宿主菌，得到BAC-HSV-1宿 主菌；

S2、BAC基因敲除系統(tǒng)的構建：將I-SceI插入到pREDI載體上，并將構建的pREDI重組質 粒電轉化至S1構建的BAC-HSV-1宿主菌，得到BAC基因敲除系統(tǒng)；

S3、同源重組片段替代擬敲除基因：以Kam-SacB全片段為模板，PCR擴增擬敲除基因的 同源重組框，先進行第一次PCR擴增，再以第一次PCR擴增產物為模板進行第二次PCR擴增， 得到同源重組片段，電轉化至S2構建的BAC基因敲除系統(tǒng)中進行第一次同源重組，由抗性基 因和SacB基因共同取代BAC-HSV-1中的擬敲除基因；

S4、基因敲除病毒株的篩選：抗性基因篩選同源重組成功菌，鼠李糖誘導I-SceI內切酶 合成，切除抗性基因和SacB基因，發(fā)生第二次同源重組，得到含單純皰疹病毒Ⅰ型基因敲除 病毒株基因的宿主菌；擴大培養(yǎng)得到的含單純皰疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株基因的宿主菌， 提取△BAC-HSV-1質粒，并將該△BAC-HSV-1質粒電轉至宿主細胞中，形成單純皰疹病毒Ⅰ型 基因敲除病毒株；

S5、將S4得到的單純皰疹病毒Ⅰ型基因敲除病毒株進行空斑純化，得到單純皰疹病毒Ⅰ 型基因重組減毒活疫苗。

5.根據權利要求4所述的單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在 于：

所述同源重組框包括擬敲除基因上下游各50bp同源序列、抗性基因和SacB基因。

6.根據權利要求5所述的單純皰疹病毒Ⅰ型基因重組減毒活疫苗的制備方法，其特征在 于：所述擬敲除基因為UL5，其同源重組框構建的第一次PCR的上游引物為 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA，下游引 物為GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC；第 二次PCR的上游引物為GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCG CACCACGCTCGC，下游引物為GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCA TCTTGCAAGAATGGCGC。