[發(fā)明專利]裂殖壺菌delta-12脂肪酸脫飽和酶相關(guān)序列及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201511005312.2
• 申請日: 2015-12-28
• 公開（公告）號: CN106916796B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設計）人: 戴小軍;蘇斐;牛其文
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/80;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明涉及裂殖壺菌delta?12脂肪酸脫飽和酶相關(guān)序列及其應用。具體而言，本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明還涉及所述多肽的編碼序列，含所述編碼序列的核酸構(gòu)建物，含所述構(gòu)建物的宿主細胞，與野生型相比能生產(chǎn)亞油酸的裂壺藻及其制備方法，以及提高裂壺藻產(chǎn)C16:1、C18:2、C20:4或EPA的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及裂殖壺菌delta-12脂肪酸脫飽和酶相關(guān)序列及其應用。

背景技術(shù)

△12脂肪酸脫飽和酶(脂肪酸脫氫酶或FAD2)是胞內(nèi)膜結(jié)合酶，負責在單不飽和脂肪酸碳鏈的第12位和13位碳原子之間引入一個雙鍵，形成多不飽和脂肪酸，是催化胞內(nèi)油酸到亞油酸代謝途徑的酶。

現(xiàn)已有多個△12脂肪酸脫飽和酶申請，如US20090186362，US20070254299，US20070028328，US20060263867，US20060263866，US20050043527，US20031072398，US9057083，US7262343，US7214491，US2009186362，US2003172398，WO2004104167，CN104212819，CN102220352，CN102199661，CN102021188。該基因一般用于構(gòu)建產(chǎn)多不飽和脂肪酸重組微生物或植物，如杜邦公司CN200480019580.3中的重組酵母，澳大利亞聯(lián)邦科學技術(shù)研究組織的CN200980154876.9和CN201210006139.8中的重組細胞，用于生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸；巴斯夫公司的CN200580007428.8中，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸專利等等，都有用到△12脂肪酸脫飽和酶。雖然選作產(chǎn)脂重組生物的宿主大多都具備較高的產(chǎn)脂肪酸能力，但為了獲得更高效率，突破宿主自身的代謝調(diào)控束縛，一般都需要以重組表達的方式，構(gòu)建一整套的脂肪酸脫飽和、延長系統(tǒng)，包含△9，△12和/或△15三個脂肪酸脫飽和酶，實現(xiàn)亞油酸、亞麻酸合成的加強，然后根據(jù)產(chǎn)物的需要選擇△6，或△6，△5，或△6，△5，△4脫飽和酶，用來特異地生產(chǎn)C18:4SDA，C20:4ARA，C20:5EPA，C22:6DHA等脂肪酸。基本上△12是改造必需的基因。

裂殖壺菌(Schizochytrium)又稱裂壺藻，屬于破囊壺菌科的一類海洋真菌。裂壺菌能夠積累大量活性物質(zhì)，如DHA、胡蘿卜素、蝦青素。采用葡萄糖或甘油做碳源發(fā)酵，細胞干重可達到150克/升，油脂占細胞干重能到70％以上，DHA占總脂肪酸35％以上，且主要以甘三酯形式存在，少量以卵磷脂形式存在〔魏萍等，裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA研究進展，食品工業(yè)科技，2010，20:398-404〕。

裂殖壺菌內(nèi)有兩套脂肪酸合成途徑，其中FAS(Fatty acid synthase)系統(tǒng)直接產(chǎn)物為C14:0和C16:0脂肪酸，然后通過脂肪酸延長、去飽和系統(tǒng)衍生為其他產(chǎn)物。PKS(polyketide synthase or PUFA synthase)系統(tǒng)直接產(chǎn)物為C22:5(DPA)和C22:6(DHA)。有研究者通過添加放射性底物的方式研究了裂壺藻內(nèi)脂肪酸的代謝途徑〔Lippmeier etal.Characterization of both polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathwaysin Schizochytrium sp.,Lipids,2009,44:621-630〕。該文章發(fā)現(xiàn)裂壺藻內(nèi)無法檢測到△9以及△12兩種脂肪酸脫飽和酶的活性，但裂壺藻在多篇公開發(fā)表的發(fā)酵結(jié)果中可以檢出油酸(△9脫飽和酶的產(chǎn)物)，但亞油酸始終未見報道，因此目前認為裂壺藻內(nèi)不存在△12脫飽和酶，這是經(jīng)典FAS產(chǎn)物衍生途徑無法產(chǎn)生DHA的主要原因。