[發明專利]豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201511000451.6
• 申請日: 2015-12-28
• 公開（公告）號: CN105463133A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 田仁鵬;吳成貢;王茵茵;鄧春興
• 申請（專利權）人: 深圳市生科源技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于病毒檢測試劑盒技術領域，尤其涉及一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

實時熒光定量PCR在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域都有廣泛應用，其基本原理為：在PCR反應體系中引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號強度，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，如圖1所示，在曲線指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可進行定量分析。

豬瘟病毒(Hogcholeravirus,Swinefevervirus)是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。豬瘟病毒主要危害豬(包括野豬)，其他動物不發病。豬瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而引起全身出血、壞死、梗塞。豬瘟對豬危害極為嚴重，會造成養豬業重大損失。豬瘟病毒兔化疫苗株是使用豬瘟病毒強毒株反復感染鈍感動物家兔，通過傳代使其毒力減弱而獲得適應兔體的毒株，由此制成的疫苗。豬瘟病毒兔化疫苗株已被廣泛應用于各國的養豬產業，為控制豬瘟起到了重要的作用。但同時，如何區分感染豬瘟病毒的豬和接種了兔化疫苗株的豬也成了行業內一大難題。傳統的豬瘟病毒檢測方法是病毒毒分離培養和ELISA為代表的血清學的檢測，但在檢測豬瘟野毒株和疫苗株時，檢測結果毫無差別。基因檢測可以作為區分野毒株和疫苗株的方案。現今廣泛使用的方案是對豬瘟病毒基因組5’UTR區域進行序列分析，5’UTR兔化疫苗株和野毒株堿基序列分別為：

5’UTR兔化疫苗株：GGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGC；

5’UTR野毒株：GGACTAGCAAACGGAGGGACTAGC；

5’UTR兔化疫苗株比野毒株多一個堿基A，在設計引物對5’UTR區域進行擴增后通過序列分析可以有效的區分野毒株和疫苗株。

現有區分野毒株和疫苗株豬瘟病毒的方法通常有一下幾種：

1)PCR-測序：設計引物將豬瘟病毒5’UTR區域進行PCR擴增，并將產物進行測序，從而區分；

2)PCR-溶解曲線分析：使用熒光染料法(SYBRgreen)對豬瘟病毒5’UTR區域進行Real-timePCR擴增檢測，實時熒光PCR結果呈陽性后對產物進行溶解曲線分析，根據解鏈溫度的不同來區分野毒株和疫苗株；

3)PCR-Taqman探針法：根據突變區域，設計兩條不同標記的Taqmen探針，分別和野毒株、疫苗株完全互補，然后優化熒光PCR體系分辨率至足以區分野毒株和疫苗株。

然而，PCR-測序法操作步驟繁瑣，成本高，很難作為常規檢測使用；PCR-溶解曲線法分辨率低，單堿基突變再溶解曲線結果上判斷偏主觀，而且對儀器要求較高，市面上大部分儀器不適用；PCR-Taqman探針法對擴增體系的分辨率優化要求較高，且當樣本濃度較低時，對結果的判斷也偏主觀。

發明內容

本發明的目的在于提供一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，旨在解決現有技術不能高效、準確區分野毒株和疫苗株豬瘟病毒的問題。

本發明的另一目的在于提供一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法。

本發明是這樣實現的，一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒，包括PCR反應液，所述PCR反應液包括豬瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA雜合探針；

所述豬瘟病毒5’UTR引物包括：

豬瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；

豬瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；

所述DNA/RNA雜合探針包括：

所述野毒株DNA/RNA雜合探針：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；

所述疫苗株DNA/RNA雜合探針：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。

以及，一種豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測方法，該方法使用上述豬瘟病毒DNA/RNA雜合探針法檢測試劑盒進行檢測，包括以下步驟：

樣本RNA提取；

RT-PCR一步法檢測；

結果判斷；

其中，所述實時熒光PCR檢測的參數設置為：

42-50℃：10-15min；