[發(fā)明專利]一種產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510996611.0
• 申請日: 2015-12-25
• 公開（公告）號: CN105462863A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐曉東;劉文瑤;張珍珍;徐娟
• 申請（專利權(quán)）人: 青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N9/20;C12N9/30;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株。

技術(shù)背景

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有廣泛的應(yīng)用價值，已成為市場上的第三大工業(yè)用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。

堿性脂肪酶是在堿性條件下水解的脂肪酶，生產(chǎn)的主要原料為小麥、玉米等農(nóng)副產(chǎn)物，通過生物發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化。它可以水解天然油脂，生產(chǎn)脂肪酸和甘油，是一種專門在異相系統(tǒng)油水接口上水解特殊酯類的酶。

目前堿性脂肪酶主要應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)，單獨(dú)或與堿性蛋白酶一起添加在洗滌劑中，作為洗滌劑的一種添加成分，它有助于脂肪油漬和人體皮脂污垢的去除。1988年，丹麥NoVo公司報(bào)道了堿性脂肪酶在洗滌劑中的應(yīng)用，并將其投入到工業(yè)化生產(chǎn)中。日本獅子油脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和聯(lián)合利華公司等中外合資公司也推出了含脂肪酶和蛋白酶的高檔洗衣粉。國內(nèi)對堿性脂肪酶的研究起步較晚，在堿性脂肪酶發(fā)酵菌種、提取工藝、酶活性以及顆粒酶制備技術(shù)等方面與國外的先進(jìn)技術(shù)有很大的差距，尤其是產(chǎn)品的生產(chǎn)成本遠(yuǎn)高于國外同類產(chǎn)品，缺乏競爭力，所以現(xiàn)在急需開發(fā)堿性脂肪酶高產(chǎn)菌株，促進(jìn)堿性脂肪酶的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)堿性脂肪酶的黑曲霉突變菌株及其應(yīng)用，是將來源于疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)的堿性脂肪酶基因轉(zhuǎn)化入黑曲霉宿主菌中，構(gòu)建高效表達(dá)堿性脂肪酶的黑曲霉工程菌；然后通過基因敲除手段敲除宿主菌自身的淀粉酶基因，再篩選獲得堿性脂肪酶產(chǎn)量明顯提高的突變菌株，為該酶的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明一方面提供了一種黑曲霉工程菌，其攜帶有表達(dá)堿性脂肪酶基因的重組質(zhì)粒。

所述的堿性脂肪酶，其氨基酸序列為SEQIDNO:1；其編碼基因的序列為SEQIDNO:2。

本發(fā)明一方面提供了一株突變菌黑曲霉Su-L2(AspergillusnigerSu-L2)，已于2015年12月16日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2015761。

本發(fā)明所述黑曲霉Su-L2在生產(chǎn)堿性脂肪酶中的應(yīng)用。

本發(fā)明構(gòu)建的黑曲霉工程菌Su-L1，在30L發(fā)酵罐發(fā)酵條件下其堿性脂肪酶活力達(dá)到10089u/ml，蛋白表達(dá)量為4.54g/L。為了進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力，本發(fā)明通過基因敲除手段敲除宿主菌自身的淀粉酶基因，篩選獲得的突變菌株黑曲霉Su-L2，其堿性脂肪酶活力達(dá)到15766u/ml，蛋白表達(dá)量為5.4g/L，比突變前分別提高了56.3％和18.9％，有利于該酶的廣泛應(yīng)用。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒pGAU圖譜；

圖2為質(zhì)粒pMD18T-pyrG圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體實(shí)施例的限定。

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

實(shí)施例1堿性脂肪酶基因的獲得

根據(jù)公共基因數(shù)據(jù)庫中的基因序列，由上海捷瑞公司合成堿性脂肪酶基因LipN(序列為SEQIDNO：2)，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO：1。

PCR引物和反應(yīng)條件如下：

引物1(F)：ATGCGGTCCTCCCTGGTGCTG

引物2(R)：TCACAGACAGGTGCCGATCAG

反應(yīng)條件為：94℃變性5min；然后94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)后，72℃保溫10min。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，LipN基因大小為876bp。