[發明專利]使用具有可酶法釋放的檢測部分的綴合物的細胞檢測

在審

• 申請號: 201510981966.2
• 申請日: 2015-12-24
• 公開（公告）號: CN105738612A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: C.多澤;J.布里登;S.米爾藤伊;T.羅克爾;V.魯道夫
• 申請（專利權）人: 美天施生物科技有限責任公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 劉辛;黃希貴

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背景

本發明涉及通過用具有經由可酶法降解的間隔物（enzymaticallydegradablespacer）連接的檢測部分和抗原識別部分的綴合物標記靶部分（targetmoieties）或靶細胞而從細胞樣品中檢測或識別靶部分或靶細胞的方法，其中在檢測到靶部分后，酶法降解所述間隔物，由此從標記的靶部分上釋放至少所述檢測部分。

綴合到一種或多種抗體上的熒光染料常用于免疫熒光分析。在過去二十年來已經開發出關于抗體、熒光染料、流式細胞儀、流式分選儀和熒光顯微鏡的大量變體以便能特異性檢測和分離靶細胞。免疫熒光技術中的一個問題是熒光發射的檢測閾，其可以例如用更好的檢測器、過濾系統、激光器或改性熒光染料增強，即具有更好的量子產率。

盡管已發現熒光標記廣泛使用，但其決不是標記和檢測細胞的唯一方式。除熒光染料外，已經發現使用其它檢測部分，如過渡金屬同位素質量標簽標記或放射性同位素標記。然后用質譜流式細胞技術（masscytometry）或閃爍測定法進行標記的檢測。

使用靶向感興趣抗原的熒光染料綴合物通過流式分選分離靶細胞產生高度純化的靶細胞組分。一個缺點在于在分選過程后，細胞仍被在分選過程中用于檢測和識別的熒光染料綴合物標記。

如對于用MHC-多聚體分離抗原特異性T細胞所述，標記的布置可能影響靶細胞（US7776562）。為避免細胞改變，最好在檢測和/或分選后有可能釋放熒光部分和抗原識別部分。US7776562公開了基于用可逆肽/MHC-多聚體或Fab-Streptamers間接非共價標記靶細胞的可逆熒光標記法。與StreptagII的低親和力肽/MHC-或Fab-單體經由streptactin多聚以提供對靶抗原具有高親合力的復合物。通過添加競爭劑生物素引發多聚化和單體化的可逆性。在離解低親和力肽/MHC-或Fab-單體后，從相互作用配偶體（interactionpartners）中釋放抗原。除StreptagII/Streptactin-相互作用外，對基于PEO-生物素/抗-生物素抗體相互作用的可逆磁性細胞分離描述了另一間接結合相互作用（EP2725359A1）。

WO20080918100公開了一種綴合物，其中酶充當熒光染料的活化劑，其可以通過該酶裂解誘發的輻射從靶細胞中釋放。

關于限定和靶向多于一個細胞群或特定亞群的多參數標記，已開發出的那些可逆間接系統表現出圖1和圖2中所示的缺點。圖1顯示通過使兩個細胞群（CD4和CD8）與抗-CD8-PEO-生物素/抗-生物素-APC和抗-CD4-PEO-生物素/抗-生物素-PE接觸而獲得的混合物。由于生物素/抗-生物素復合物的可逆性質，所得平衡包含4種而非2種細胞-染料綴合物。通過復合物的動力學和熱力學特征測定所得平衡，并在導致各靶抗原的熒光標記的不同結合配偶體與這兩個熒光部分都交換后達到所得平衡。獲得幾乎不可預測的混合物而非特異性標記。圖2a和b顯示這一效應的兩個實例。交換程度取決于參數，如圖2a和b中所示的抗-生物素-熒光染料-綴合物的選擇，以及該復合物的組分的濃度。因此基于可逆間接系統的可逆熒光標記僅適用于單參數標記而不適用于多參數標記。與可逆間接系統相比，共價綴合的抗原識別部分和檢測部分提供具有靶向多參數的可能性的特異性標記。用共價綴合的抗-CD4-PE和抗-CD8-APC特異性標記CD4⁺-和CD8⁺-靶細胞的一個實例顯示在圖2c中。

除基于抗原識別部分和檢測部分之間的間接非共價結合相互作用的特異性競爭的可逆系統外，為磁性細胞分離開發出幾種其它可逆系統。在分離后從靶細胞中釋放磁性粒子的已知方法是機械攪拌或與磁性粒子的可化學或酶法裂解的連接物。例如，US6190870和WO96/31776公開了基于用葡聚糖涂布和/或經葡聚糖連接到抗原識別部分上的磁性粒子的磁性細胞分離。隨后通過添加葡聚糖降解酶葡聚糖酶引發從該磁性粒子上裂解分離的靶細胞。除葡聚糖基磁性粒子外，在US5719031中描述了葡聚糖-熒光染料-綴合物的消化。在這種情況下，葡聚糖-熒光染料-綴合物的標記程度高到足以提供熒光猝滅。因此降解伴隨著用于量化酶消化過程的熒光發射信號的增強。