[發(fā)明專利]一種產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法

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• 申請日: 2015-12-15
• 公開（公告）號: CN105400728A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王丹;鄒環(huán)澤;包謝茹;周小華
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/34;C12R1/125
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一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)工程。

二、背景技術(shù)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，學名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside，galactohydrolase，EC3.2.1.23)，商品名為乳糖酶(Lactase)，能夠催化乳糖或乳糖類似物中β-1，4-半乳糖苷鍵的水解反應。

β-半乳糖苷酶廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)學及生化分析等領(lǐng)域，尤其在乳品工業(yè)中起到極大的作用。常用于水解牛乳和其他乳制品中的乳糖，也可用來生成低聚半乳糖，廣泛適用于低乳糖牛奶和非結(jié)晶型濃縮牛奶的生產(chǎn)，將乳糖降解為葡萄糖和半乳糖以生產(chǎn)低乳糖奶，從而有效解決乳糖不耐癥等問題。

β-半乳糖苷酶主要來源于動植物和微生物中。由于微生物具有生長速度快、代謝效率高及分離純化相對簡單等優(yōu)勢，微生物β-半乳糖苷酶成為工業(yè)化酶制劑的主要來源。但不同來源的乳糖酶酶學性質(zhì)差異較大，如黑曲霉、米曲霉等來源的霉菌乳糖酶，催化溫度較高(40～55℃)，但最適反應pH值較低(pH3.0～4.5)，適合奶酪加工副產(chǎn)物酸性乳清的處理；乳酸克魯維酵母和脆壁克魯維酵母等酵母來源的乳糖酶最適反應溫度在中溫附近(35～40℃)，而最適反應pH近中性(pH6.5～7.0)，適合牛奶加工中低乳糖奶(pH6.5～6.8)的生產(chǎn)：細菌乳糖酶比較復雜，最適反應溫度從低溫、中溫到高溫及超高溫都有，但一般而言最適反應pH都在中性附近。

目前乳品工業(yè)用于分解乳糖的β-半乳糖苷酶多從酵母、曲霉菌或乳酸菌中經(jīng)誘導產(chǎn)酶后提取獲得。盡管目前諸多文獻報道了篩選分離多種β-半乳糖苷酶菌株，如酵母菌、乳酸菌屬、芽抱桿菌屬、曲霉菌屬等系列菌株的方案，但目前生產(chǎn)所用的β-半乳糖苷酶大多最適作用溫度在30℃左右，在高溫下的酶活力都很低，且成本高，難以滿足市場及生產(chǎn)所需，且均存在熱穩(wěn)定性還不夠好的缺點，嚴重限制了它在乳制品中的應用。如果采用耐高溫β-半乳糖苷酶則將可克服熱穩(wěn)定性差的缺陷，酶在60℃及以上溫度水解乳糖，可以有助于抑制雜菌微生物的生長。而且酶反應速度快，酶用量低，反應時間短，生產(chǎn)中可與巴氏殺菌同時進行或冷卻階段保溫水解，即在巴斯德消毒過程中同時進行乳糖水解，將乳糖水解與巴氏消毒工序合二為一，不僅縮短生產(chǎn)周期，而且可以充分利用巴氏消毒的余熱以降低能耗，從而顯著節(jié)省生產(chǎn)成本。同時，針對其運輸問題，也對它的耐熱性提出要求。

我國據(jù)流行病調(diào)查研究表明，乳糖不耐癥主要是有色人種比例較高，以亞洲人和美國黑人發(fā)生率最高。我國居民中約有75％～95％的人患有不同程度的乳糖不耐癥。因此針對中國人，乳糖酶有著尤其重要的研究價值和意義。β-半乳糖苷酶還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用，用于生產(chǎn)雙歧因子，從而在益生菌食品生產(chǎn)中廣泛應用。同時，在2015年1月，兩岐雙歧桿菌(Biofidobacteriumbifidum)被列為國家食品添加劑新品種。使得β-半乳糖苷酶將在食品加工行業(yè)具有更大的作用。

如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，加快研發(fā)耐高溫的β-半乳糖苷酶產(chǎn)品，已成為當今生物化工技術(shù)領(lǐng)域中函待解決的重點難題之一，具有十分重大的意義。類似的像公布號為CN103614313A，名為一種發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法，以及公布號為CN102250856A，名為一種耐熱β-半乳糖苷酶突變體的構(gòu)建，分別提出發(fā)酵產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法和耐熱β-半乳糖苷酶突變體的構(gòu)建方法，都對研究如何產(chǎn)耐高溫的β-半乳糖苷酶做出了一定貢獻，但菌株是否高產(chǎn)和是否易于分離上沒有明確的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株及其篩選方法，該菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的周期短、速度快、遺傳穩(wěn)定性好、熱穩(wěn)定性好、pH穩(wěn)定性好、酶催化活力強，且培養(yǎng)條件簡便、生產(chǎn)安全性高，耐高溫。

根據(jù)本發(fā)明提出的一種耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于所述的菌株Z89的分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明提出的一種產(chǎn)耐高溫β-半乳糖苷酶的菌株的篩選方法，其特征在于依次包括如下步驟：

步驟一，樣品采集：土壤樣品采于溫泉及牛奶場土壤；