[發(fā)明專(zhuān)利]一種人皮膚干細(xì)胞體外分化單倍體生殖細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510975331.1
• 申請(qǐng)日: 2015-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105368773A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛偉;孫源超;沈偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/076
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/076;C12N5/075
• 代理公司: 青島高曉專(zhuān)利事務(wù)所 37104
• 代理人: 張世功

1.一種人皮膚干細(xì)胞體外分化單倍體生殖細(xì)胞的方法，其特征在于按照如下步驟操作： 第一步，人皮膚來(lái)源干細(xì)胞的體外分離：將人的皮膚組織在顯微鏡下去除脂肪組織以及血凝 塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用剪刀將皮膚組織剪成小塊，之后用含100U/ml青霉素和100mg/ml 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液清洗3遍，離心后棄掉培養(yǎng)液，將剪碎的皮膚組織用胰酶替代物 TrypLEExpress的消化液中37℃消化，消化結(jié)束后，加入DMEM/F12培養(yǎng)液再次清洗3遍， 清洗結(jié)束后，用槍頭吹打皮膚組織塊，使皮膚組織塊中的皮膚來(lái)源干細(xì)胞脫落下來(lái)，之后用 細(xì)胞篩將吹打下來(lái)的單細(xì)胞分離出來(lái)；第二步，體外培養(yǎng)人的皮膚來(lái)源干細(xì)胞：將獲得的單 細(xì)胞懸液用人的皮膚來(lái)源干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的人皮膚來(lái)源干細(xì)胞在 培養(yǎng)2-3天后即可在倒置顯微鏡下觀(guān)察到克隆形態(tài)的形成，人的皮膚來(lái)源干細(xì)胞每隔3-4天 傳代一次，傳代時(shí)，將原有的皮膚干細(xì)胞克隆以及培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，之后 棄掉上清，加入新鮮的培養(yǎng)液，將克隆球吹打至原來(lái)體積的1/2-1/3，之后接入一個(gè)新的培 養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；所述人皮膚來(lái)源干細(xì)胞培養(yǎng)液包含DMEM/F12，20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，2％ B-27血清替代物，40ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素； 第三步，人皮膚來(lái)源干細(xì)胞向生殖細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)：收集傳代兩次后的人皮膚來(lái)源干細(xì) 胞克隆，TrypLEExpress消化成單細(xì)胞懸液，用生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸單細(xì)胞懸液，將細(xì) 胞懸液接到懸浮的24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔兩天換液一次；所述生殖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括 TCM199，5μl/ml胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉，3mg/ml牛血清蛋白，1mg/ml胎球蛋白，0.23 mM丙酮酸鈉，1ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，20ng/ml激活素A和30ng/ml骨形態(tài)發(fā)生蛋白4， 100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素；第四步，用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)單倍體樣生殖細(xì)胞形成： 將生殖細(xì)胞誘導(dǎo)四天的人皮膚來(lái)源干細(xì)胞克隆用TrypLEExpress進(jìn)行消化，將獲得的單細(xì)胞 懸液離心，棄掉上清后，用條件培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接到貼壁的24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程 中兩天換液一次，換液時(shí)，輕輕地從邊緣吸出150μl舊培養(yǎng)液，加入200μl新鮮的條件培 養(yǎng)基，在誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，DNA倍性分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在分化的第18天，能夠檢測(cè)到1.79％的 單倍體細(xì)胞的形成；所述條件培養(yǎng)基包括DMEM/F12，15％的胎牛血清，1500U/ml白血病抑 制因子，50mIU促卵泡素，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，2％B-27血清替代物，5μl/ml胰島 素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人皮膚干細(xì)胞體外分化單倍體生殖細(xì)胞的方法，其特征在 于第四步所述人皮膚來(lái)源干細(xì)胞在單倍體誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化時(shí)，通過(guò)檢測(cè)分化不同時(shí) 間SCP3和γH2AX的表達(dá)，能夠檢測(cè)到線(xiàn)狀的SCP3染色信號(hào)，人皮膚來(lái)源干細(xì)胞在單倍體誘 導(dǎo)條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化時(shí)，能夠啟動(dòng)減數(shù)分裂；通過(guò)熒光原位雜交檢測(cè)分化的人皮膚來(lái)源干 細(xì)胞，能夠檢測(cè)到單個(gè)熒光信號(hào)的類(lèi)單倍體細(xì)胞存在。