[發(fā)明專利]一種人類金屬硫蛋白-2a融合蛋白表達(dá)載體有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510971339.0 | 申請日： | 2015-12-22 |
| 公開（公告）號： | CN105483150B | 公開（公告）日： | 2018-11-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李萬波;陜婧婧;盧嬋 | 申請（專利權(quán)）人： | 盤古基因生物工程(南京)股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/70;C12N15/62 |
| 代理公司： | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218 | 代理人： | 傅婷婷;徐冬濤 |
| 地址： | 210032 江蘇省南京市浦*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 人類 金屬 蛋白 融合 表達(dá) 載體 | ||
本發(fā)明公開了一種人類金屬硫蛋白?2a融合蛋白表達(dá)載體。所述表達(dá)載體克隆區(qū)的上游包含人類脂肪酸結(jié)合蛋白(hFABP6)，下游為金屬硫蛋白MT2a。本發(fā)明還揭示了應(yīng)用所述表達(dá)載體的方法，包括表達(dá)菌株的構(gòu)建、擴增、誘導(dǎo)表達(dá)、融合蛋白純化的基本方法。本發(fā)明所揭示的hFABP6?MT2a融合蛋白表達(dá)載體具有如下特點：①高效表達(dá)MT2a蛋白；②可溶性表達(dá)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種人類金屬硫蛋白-2a融合蛋白表達(dá)載體，尤其是涉及一種具有伴侶樣蛋白功能的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白與人類金屬硫蛋白的融合表達(dá)。
背景技術(shù)
1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學(xué)作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質(zhì)，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質(zhì)稱為金屬硫蛋白(英文為Metallothionein，簡稱MT)。
關(guān)于金屬硫蛋白,全球從1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美國共舉行了四次國際專題研討會，第五次國際專題研討會于2005年10月在北京召開。1987年我國將MT列入[863]計劃，“八五”、“九五”重大攻關(guān)項目，1994年列入國家級[火炬計劃]；2003年MT項目被國家科技部列為“國家科技成果重點推廣計劃項目,1995年聯(lián)合國將MT列入向世界各國推薦的生物技術(shù)產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對MT的研究、開發(fā)、推廣、應(yīng)用的高度重視。
金屬硫蛋白(Metallothionein，MT),又稱巰基金屬結(jié)合蛋白。一類非酶蛋白質(zhì)，除含有鎘(Cd)、鋅(Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、鉍(Bi)等元素的MT。MT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50％的金屬離子發(fā)生解離的pH值分別為：Zn-MT:3.5～4.5；Cd-MT:2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關(guān)的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有一個吸收峰。所有脊椎動物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT，其氨基酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。
人類MT按分子特征和分布分為四個亞群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9個亞類，MT2又分MT2a和MT2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于腦，MT4主要分布于皮膚。
自由基是人體衰老的第一大元兇，自由基還與人類若干中老年疾病緊密相關(guān)，導(dǎo)致人體免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除劑，減少自由基就能延緩人體衰老步伐。同時，MT也是目前唯一有效的重金屬解毒和清除蛋白。人體重金屬超標(biāo)或中毒，損害肝、腎、骨、腦和記憶功能，引發(fā)多種疾病。
大量的科學(xué)實驗和臨床結(jié)果表明：MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療或緩解消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、保護皮膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。
目前MT產(chǎn)品主要從兔肝、馬腎、豬肝和微生物(如粗脈孢菌)等中提取，成本高、產(chǎn)量低，抑制了她的廣泛使用，比如食品、飲品、化妝品等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體。
本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體，所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達(dá)載體是將人類金屬硫蛋白-2a(MT2a)的編碼序列作為目標(biāo)蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體的多克隆區(qū)所得；所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達(dá)載體上游含有人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白-6的編碼序列，人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭區(qū)和用于插入目標(biāo)蛋白編碼序列的多克隆區(qū)。
所述的人類游離脂肪酸結(jié)合蛋白的同源性與人類天然游離脂肪酸結(jié)合蛋白的同源性等于或大于85％。所編碼的
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