[發(fā)明專利]一種用于培養(yǎng)病毒的無血清培養(yǎng)基及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510965947.0
• 申請(qǐng)日: 2015-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN105441376A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑞愛;徐家華;張文炎;何芳;唐兆新;高艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/07
• 分類號(hào): C12N5/07
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種用于培養(yǎng)病毒的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)

二十世紀(jì)以來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為工業(yè)化生產(chǎn)生物活性物質(zhì)、疫苗、載體，如單克隆抗體、藥用蛋白質(zhì)、基因工程藥物等常用的手段，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與基因工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)密切相關(guān)，在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了關(guān)鍵的核心作用。此外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日臻完善，促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)、病毒培養(yǎng)技術(shù)等的發(fā)展。從當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)來看，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、無血清培養(yǎng)是近年來生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向。

目前，許多獸用疫苗都通過細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過程往往需要使用血清，而血清的存在增加了細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物安全性的不確定因素，具有可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)、批次間差異大、易受污染和成本較高等缺點(diǎn)。此外，血清中成分較為復(fù)雜，多含有分子量較大的組分，影響病毒的分離純化，且容易被支原體感染，這一現(xiàn)實(shí)問題已經(jīng)成為動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用發(fā)展動(dòng)力。隨著無血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供了必要的技術(shù)支撐，無血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢(shì)。

無血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿足病毒的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因此，發(fā)展無血清培養(yǎng)基是利用病毒生產(chǎn)疫苗重要條件。目前已有一些市售細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，但是現(xiàn)有市售無血清培養(yǎng)基存在細(xì)胞增殖不夠理想、價(jià)格昂貴等缺陷。

中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01410467191.2的發(fā)明專利申請(qǐng)文件，無血清培養(yǎng)基及其用途和一種豬病毒的培養(yǎng)方法，該無血清培養(yǎng)基以MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加的氨基酸及其他組分多達(dá)45種，組分非常復(fù)雜。

因此，現(xiàn)有技術(shù)存在細(xì)胞貼壁性差，組分過于復(fù)雜，細(xì)胞增殖速率不夠理想等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種便于病毒繁殖、質(zhì)量可控、安全可靠用于培養(yǎng)病毒的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。

為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種用于培養(yǎng)病毒（本發(fā)明中的培養(yǎng)病毒是指將病毒接種到宿主細(xì)胞后，移種到培養(yǎng)基中，病毒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，最后使宿主細(xì)胞裂解的過程）的無血清培養(yǎng)基由以下重量百分?jǐn)?shù)計(jì)的組分制備而成：80-90%培養(yǎng)液、4-10%氨基酸、3-10%血清替代因子和0.05-0.5%抗氧化劑；

所述培養(yǎng)液選自MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基（1:1）、HB培養(yǎng)基、BEM培養(yǎng)基中的一種；

所述氨基酸由以下重量的組分組成：賴氨酸1-2g、色氨酸1.5-2g、苯異亮氨酸0.5-1g、纈氨酸0.5-2g、蘇氨酸1-1.5g、亮氨酸0.5-1g、甘氨酸0-1g、異亮氨酸0-1.5g、絲氨酸0.5-1g、天冬氨酸0.5-1.5g、精氨酸0.5-1g和谷氨酰胺0-1.5g；

所述血清替代因子為生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子一種或幾種；

所述抗氧化劑為抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素E、類胡蘿卜素、尿酸、枸櫞酸、EDTA、泛醌和多酚類抗氧化劑中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，所述生長(zhǎng)因子為胰島素、白介素-2、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子、皮質(zhì)醇和甲狀腺激素中的一種或幾種；

所述結(jié)合蛋白為轉(zhuǎn)鐵蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金屬蛋白和色蛋白中的一種或幾種；

所述貼壁因子為魚精蛋白、聚賴氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，所述血清替代因子為生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁因子和微量元素的混合物。

進(jìn)一步地，所述血清替代因子為生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白和貼壁因子以(0.2-1):(0-1):(0.2-1)

配比混合所得的混合物。

優(yōu)選地，一種用于培養(yǎng)病毒的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基由以下重量百分?jǐn)?shù)計(jì)的組分制備而成：90%培養(yǎng)液、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化劑；

所述氨基酸由以下重量的組分組成：賴氨酸1g、色氨酸1.5g、苯異亮氨酸0.5g、纈氨酸0.5g、蘇氨酸1g、亮氨酸1g、甘氨酸1g、異亮氨酸0.5g、絲氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g、精氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g；

所述生長(zhǎng)因子為：皮質(zhì)醇；

所述結(jié)合蛋白為：轉(zhuǎn)鐵蛋白；

所述貼壁因子為：魚精蛋白；

所述血清替代因子為皮質(zhì)醇、轉(zhuǎn)鐵蛋白和魚精蛋白以0.8:1:1配比混合所得的混合物；