[發明專利]基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201510922111.2
• 申請日: 2015-12-14
• 公開（公告）號: CN105420361B
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 黃志清;施純玫;王勁;翁芳霞;陳強
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

為了克服現有方法及試劑盒的不足,本發明提供了一種基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒，屬于基因突變檢測領域。本發明通過在EGFR基因片段擴增體系中引入耐熱DNA連接酶和針對突變位點處的特定連接引物組，可以基于擴增片段條帶直接判定野生型樣本或使得低突變含量樣品其最終的PCR產物中突變片段的比例高于50%；然后通過變性和退火，制備在突變位點處含有錯配構造的DNA片段雜交樣品，從而利用錯配切除酶實現對雜合基因片段樣品的有效檢測。本發明方法及試劑盒可以基于酶切檢測出樣本中含量低至1%的EGFR基因突變，準確率極高，檢測時間較短且費用低廉，適合于臨床檢測。

技術領域

本發明屬于基因突變檢測領域，尤其涉及基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法和試劑盒。

背景技術

人類表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一種由原癌基因C-erbB-1(HER-1)編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，廣泛表達于大部分正常上皮細胞中。然而在許多實體腫瘤（如非小細胞肺癌）中往往存在EGFR高表達或異常表達的情況，這與腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、轉移及凋亡的抑制有關，因此EGFR已經成為相關腫瘤（尤其是非小細胞肺癌）靶向治療的一個重要靶點。目前應用于臨床的EGFR靶向藥物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄羅替尼即特羅凱)，以及EGFR單克隆抗體如西妥昔單抗。大量研究表明, 吉非替尼（Gefitinib）和厄羅替尼（Erlotinib）的療效與EGFR基因尤其是其18-21號外顯子的突變狀況密切相關。攜帶EGFR基因突變的肺癌患者對酪氨酸激酶抑制劑高度敏感，患者將得到很大的受益；反之野生型基因的患者將基本不受益，因此EGFR基因檢測作為非小細胞肺癌等癌癥靶向藥物選用的前提被列入了最新的NCCN（美國國家綜合癌癥網絡）腫瘤臨床實踐指南。

目前報導的EGFR基因突變檢測方法包括Sanger測序、Scorpions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在科研和臨床中較為常用的方法為Sanger測序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探針；Amplification refractory mutation system,擴增阻滯突變系統)法。Sanger測序法是基因突變/多樣性檢測的金標準，具有技術和平臺成熟、結果準確和全面等優點；然而Sanger測序法主要的不足在于檢測靈敏度約只有10-20%左右（即突變基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠檢出），且檢測過程繁瑣、檢測時間長（大致需要2天），這制約了其臨床應用。基于Scorpions-ARMS法開發的如德國Qiagen公司的EGFR檢測試劑盒，可同時檢測EGFR基因的29種常見突變,具有靈敏度高（可測出低至1%水平的突變）、操作簡單、快速檢測等優點；然而該類進口試劑盒檢測成本過高（每份標本需3000-5000元）限制了其臨床的推廣和應用。

發明內容

為了克服現有人類EGFR基因突變檢測方法和試劑盒的不足, 本發明的目的之一在于提供一種基于酶切靈敏檢測人類EGFR基因突變的試劑盒；本發明的另一個目的在于提供一種基于酶切的靈敏檢測人類EGFR基因突變的方法。

由于在EGFR基因片段的擴增體系中加入了針對突變位點的連接引物和耐熱DNA連接酶，導致樣品中的野生型EGFR基因片段的擴增將受到有效的抑制，而突變型的擴增則基本不受影響；因此使得突變含量低至1%的樣品其最終的擴增產物中突變片段的比例高于50%，從而保證了酶切對于雜合基因片段體系的有效檢測。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下：