[發明專利]用于菌種保藏的保藏液及重組大腸桿菌高密度發酵方法

在審

• 申請號: 201510920090.0
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN106867905A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 熊思馳;董宇亮;章文蔚;陳奧;鄭越;陳波宏;許軍強;楊成功
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/20;C12R1/19
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 彭家恩,羅瑤

1.一種用于菌種保藏的保藏液，其特征在于：由緩沖溶液和溶解于緩沖溶液中的溶質組成，所述緩沖溶液為pH值6.2-7.0的磷酸鹽緩沖液或檸檬酸緩沖液，所述溶質包括低聚糖、甘油、甘露醇、脫脂奶粉和瓊脂糖。

2.根據權利要求1所述的保藏液，其特征在于：所述低聚糖選自海藻糖、蔗糖和麥芽糖中的至少一種。

3.根據權利要求1或2所述的保藏液，其特征在于：所述溶質中包括100重量份的低聚糖，30-40重量份的甘油，50-60重量份的甘露醇，180-200重量份的脫脂奶粉，0.5-0.8重量份的瓊脂糖。

4.根據權利要求1或2所述的保藏液，其特征在于：所述保藏液中，所述緩沖溶液和所述溶質的重量比為1:(8-15)。

5.一種如權利要求1-4任一項所述的保藏液在重組大腸桿菌的菌種保藏中的應用。

6.一種如權利要求1-4任一項所述的保藏液在基因工程菌的高密度發酵中的應用。

7.一種重組大腸桿菌的高密度發酵方法，其特征在于：包括采用三級菌種保藏方法建立原始菌種庫、主代菌種庫和工作菌種庫，所述工作菌種庫采用權利要求1-4任一項所述的保藏液，保存于-80℃至26℃，優選的保存于0℃-26℃；并且，采用所述工作菌種庫的菌種進行高密度發酵，所述高密度發酵依序包括劃線培養、搖床活化培養、種子液培養、種子罐培養和發酵罐培養。

8.根據權利要求7所述的高密度發酵方法，其特征在于：所述工作菌種庫采用權利要求1-4任一項所述的保藏液，保存于4℃-10℃。

9.根據權利要求7所述的高密度發酵方法，其特征在于：所述原始菌種庫和/或主代菌種庫也是采用權利要求1-4任一項所述的保藏液，保存于-80℃至26℃，優選的保存于0℃-26℃。

10.根據權利要求7-9任一項所述的高密度發酵方法，其特征在于：所述發酵罐培養包括，將所述種子罐培養的菌液接種到發酵罐中進行通氣攪拌培養，所述通氣攪拌培養的初始培養條件為，轉速100-150rpm，通氣量0.9-1.2vvm，溫度35-37℃，罐壓0.03-0.05MPa；當溶氧低于20％時，提高轉速至200-800rpm，提高通氣量至1.5-2.5vvm；當發酵OD600至30以上時，加入誘導劑，同時，將發酵罐溫度由35℃-37℃降為25℃-27℃，繼續培養至發酵結束；整個發酵過程中，調節補料速度，使pH值保持7.0-7.1；所述誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷。