[發明專利]從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法

在審

• 申請號: 201510918998.8
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105388055A
• 公開（公告）日: 2016-03-09
• 發明（設計）人: 趙安;凌志強;毛偉敏
• 申請（專利權）人: 浙江省腫瘤醫院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 周麗娟

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體(exosome)的方法。

背景技術

外泌體(Exosome)是一種穿梭在細胞間具有雙分子層的納米級囊泡。外泌體可由多種細胞分泌到細胞外，不同細胞分泌的外泌體可以具有類似的或不同的特性和生物學功能。腫瘤細胞也能釋放外泌體，且腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到細胞外影響腫瘤微環境，其在腫瘤發生、發展中所扮演的角色已經越來越受關注。外泌體不僅在體液如血清、血漿、尿液中能穩定存在，還能選擇性的包裹/釋放其細胞中的遺傳信息(miRNA、蛋白等)，因此提取細胞外的外泌體用于疾病、腫瘤等的診斷、監控有巨大的應用潛能。

目前，外泌體提取的研究主要集中在細胞、血清樣本中提取外泌體，其主要采取的提取方法有：超高速離心法、過濾離心法、密度梯度超高速離心法、免疫磁珠結合超高速離心法、色譜法。這些方法各有缺點，例如，超高速離心法以及免疫磁珠結合超高速離心法均需要采取100000g及以上的超高速離心，對設備要求高，提取成本昂貴；再例如，超高速離心法和過濾離心法均存在純度不高的問題；密度梯度離心法雖然純度高但其步驟繁雜、耗時、量少；色譜法需要特殊的設備，應用不廣泛。此外，無論是從細胞還是血清樣本中提取外泌體，在樣本收集中都不可避免地會對患者進行創傷性操作，以獲取血液或細胞，并且，為了滿足后續檢測的實驗要求，有時候需要收集大量的樣本，因此，類似的有創提取方式在臨床應用上存在很大的局限性。所以，尤其需要發展一種能夠可靠、快速、經濟地無創分離提取外泌體尤其是腫瘤來源的外泌體的方法。

外泌體在尿液中能穩定存在，而且，尿液樣品容易大量獲得并能避免創傷性損傷，因此，如果能夠檢測尿液外泌體中的腫瘤信息，則有望將其用于腫瘤的無創診斷、監控等應用。但是，實際上，由于單位體積尿液中的外泌體含量非常低，采用一般方法單次提取得到的外泌體，根本無法滿足后續檢測測序的要求，因此，鮮少有文獻報道尿液中外泌體的提取方法。在現有的為數極少的提取尿液中外泌體的相關文獻中，均明顯存在不少問題而導致無法臨床應用。例如：題為“IsolationandPurificationofExosomesinUrine”的文章(GonzalesPA等，MethodsMolBiol.2010；641:89-99)中公開了兩種從尿液中分離外泌體的方法，采用超速離心或超濾管的方法提取了外泌體，其中，超速離心的方法，污染雜質較多，操作也非常繁瑣，還需要配置超高速離心機，臨床應用推廣困難；而借助超濾管的方法，雖然能避免超高速離心機的使用，但是避免不了其他蛋白聚集或大分子蛋白復合體等的殘留，對后續針對exosome的實驗研究也會帶來錯誤信息。此外，尿液中的外泌體來源非常復雜，無法評估其中屬于腫瘤細胞分泌的外泌體。基于以上的限制，目前尚未有文獻公開報道從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體(exosome)的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法，能夠從腫瘤患者的尿液中獲得高量、特異性高且能直接用于后續的流式技術檢測的腫瘤細胞來源的外泌體。

一種從尿液中分離腫瘤細胞來源的外泌體的方法，依次包括以下步驟：

(1)將尿液樣本收集于第一離心管中，2～8℃、300～500g離心10～15分鐘，分離得到上層液體；

(2)將所述上層液體進行冷凍干燥，得到沉淀；

(3)用緩沖液將所述沉淀進行重懸，得到第一重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7～8；將所述第一重懸液在2～8℃、10000～12000g離心30～40分鐘，分離得到上清液；

(4)將所述上清液與總外泌體抽提液以2:1的體積比在第二離心管混合，震蕩均勻后，2～8℃孵育6～16小時，然后，將孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g離心60～80分鐘，移除上層清液后，在所述第二離心管的底部得到固相物質，為尿液總外泌體；

(5)用緩沖液將所述尿液總外泌體進行重懸，得到第二重懸液，為尿液總外泌體的重懸液，其中，所述緩沖液的pH值為7～8；

(6)將所述第二重懸液加入到吸附有上皮細胞粘附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)抗體標記磁珠的第三離心管中，2～8℃孵育6～16小時；

(7)將所述第三離心管置于磁力架，吸附2～10分鐘，移除管內液體，這樣在所述第三離心管中得到磁珠結合的腫瘤細胞來源的外泌體。