[發(fā)明專利]一種從臍帶外層羊膜組織中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510918960.0
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN105420184A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭鐳
• 申請（專利權(quán)）人: 郭鐳;里程;圣釋（北京）生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京瑞恒信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的穩(wěn)定分離提取方法，特別是從臍帶外層羊膜組織中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。MSC于20世紀(jì)70年代末首次發(fā)現(xiàn)于骨髓中，然而直到上個(gè)世紀(jì)90年代，MSC多向分化潛能被人們認(rèn)識(shí)后，這種干細(xì)胞才受到越來越多的關(guān)注。

間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，目前已有研究表明，MSC可以經(jīng)誘導(dǎo)分化為脂肪、骨、骨韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮、胰島等多種組織細(xì)胞以及類細(xì)胞；并且發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫抑制、內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及心血管功能改善等方面均具有明顯的功效。

目前對間充質(zhì)干細(xì)胞的提取研究也已較為廣泛，包括從脂肪、骨髓、羊水、胎盤、臍帶組織、臍帶血、牙周等人體多種組織和器官中進(jìn)行提取。其中臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞由于生長環(huán)境單一、體外提取方便，使得提取的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高、數(shù)量大，可以成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，具有更廣闊的臨床應(yīng)用潛能。

鑒于臍帶多能干細(xì)胞的多向分化潛能以及在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，目前國內(nèi)市場的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的存儲(chǔ)業(yè)務(wù)具有廣闊的前景，因此，如何高效規(guī)范的保證干細(xì)胞的分離提取率，以及保證干細(xì)胞優(yōu)質(zhì)，從而滿足未來干細(xì)胞移植的臨床需求，是目前國內(nèi)干細(xì)胞存儲(chǔ)業(yè)務(wù)亟待解決的問題。

目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多采用酶消化法和組織貼壁法來制備，然而在分離提取過程中，紅細(xì)胞的干擾是影響臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量的重要因素，大量紅細(xì)胞的存在使得間充質(zhì)干細(xì)胞的生長空間受限，同時(shí)影響干細(xì)胞的活力狀態(tài)，對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取與開發(fā)利用造成了很大的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對本領(lǐng)域的需要，提供一種能夠克服紅細(xì)胞干擾的改進(jìn)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取方法。

本發(fā)明的另一目的是提供通過本發(fā)明的方法獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

具體而言，本發(fā)明針對目前國內(nèi)外人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取現(xiàn)狀，利用紅細(xì)胞裂解液并采取懸浮培養(yǎng)從新鮮臍帶外層羊膜組織中分離原代間充質(zhì)干細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)并進(jìn)行穩(wěn)定傳代，以提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取成功率和細(xì)胞純度，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供可能。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下。

一方面，本發(fā)明提供了從新鮮臍帶離體組織外層羊膜中分離和提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其為一種分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括：采用紅細(xì)胞裂解液處理從臍帶分離的外層羊膜組織，并采用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明采用的紅細(xì)胞裂解液為包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，優(yōu)選為包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更優(yōu)選為包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH為7.2-7.4。在使用之前，過0.22μm微濾膜，平衡至室溫。

本發(fā)明采用的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長因子(b-FGF)和血清替代物。

優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包含0.05-0.2體積份的β-巰基乙醇、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、8-12體積份的血清替代物、85-95體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包含0.1體積份的β-巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、10體積份的血清替代物、89體積份的a-MEM/DMEM-F12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長因子；最優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巰基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重組人堿性成纖維生長因子和血清替代物組成。

根據(jù)本申請的具體實(shí)施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司貨號為11140的產(chǎn)品。