[發明專利]一種達氏鱘精原細胞培養液及應用

有效

• 申請號: 201510905841.1
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN105316282B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 頡璇;厲萍;危起偉;葉歡;楊曉鴿;馬杰;曾令兵;李創舉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院長江水產研究所
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩;王敏鋒

本發明公開了一種達氏鱘精原細胞培養液及應用，本發明提供了一種無胎牛血清、以各種生長因子、非必須氨基酸、丙酮酸鈉等添加劑作為替代物，同時輔以少量雄性達氏鱘血清的低血清培養基，可保證精原細胞的大量增殖且精巢細胞增殖率較低，將培養至第13天的精巢細胞13d摻入25μM BrdU標記新增殖細胞，24h免疫組化實驗顯示摻入BrdU 24h后新增殖細胞中帶有生殖細胞標記的細胞的比例為85.78%。本發明解決了目前達氏鱘精原細胞原代無法大量培養的問題，為達氏鱘生殖發育研究提供有效的細胞平臺。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種達氏鱘精原細胞培養液及應用。

背景技術

達氏鱘(Acipenserdabryanus)屬鱘形目，鱘科，鱘屬，又名沙臘子、長江鱘，是我國特有物種，為淡水定居性鱘魚類(丁瑞華1994)。主要分布于金沙江下游及長江上游，具有較高的經濟價值和科研價值。近年來，由于環境污染、生境破壞、航運和過度捕撈等因素,野生達氏鱘種群數量急劇下降。近20年來，由于葛洲壩工程的興建以及長江上游的環境污染、過度捕撈等原因，達氏鱘的資源已極為稀少(ZhuangPing et al 1996,Zhanghui et al2011)。1988年，達氏鱘被世界自然與資源保護聯盟(International Union for theConservation of Nature and Natural Resources)紅色名錄列為極度瀕危(Criticalendangered,CR)物種。因此，開展達氏鱘種質資源保護技術的研究，對于保護達氏鱘物種資源，對于品種的開發利用等都有重要的意義。

2006年，日本學者Okutsu等建立了虹鱒的精原細胞移植技術。將A型精原細胞的一部分移植到腹膜受體虹鱒胚胎，向受體胚胎生殖腺移動，并在其內增殖，然后產生了大量功能性的精子。這些結果在功能上證實魚精巢中存在精原細胞。此外，Okutsu還發現精原細胞合并到雌魚卵巢中，分化為功能齊全的卵，表明整合的精原細胞具有雙性潛能。最后，正常生物個體可以通過來自供體精原細胞形成的配子受精產生。2007年，代理親魚技術建立，可將精原細胞異種移植入近緣種。通過這種技術，可將苗種生產昂貴、世代時間長的大型魚類的精原細胞移植到親緣關系相近但體型較小，世代時間較短的魚種中，縮短世代時間。因此達氏鱘精原細胞移植可作為達氏鱘物種保護的對策之一。通過建立一種達氏鱘精原細胞體外培養方法，可使精原細胞長時間在體外擴增和維持，并同時保持其原有的特性，可以保證用于移植的精原細胞長期大量穩定的供應。

目前魚類精原細胞體外培養研究大多集中在斑馬魚(Danio rerio)(Sakai 2002，Kurita2004)青鳉(Oryziaslatipes)(Hong 2004)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)(Miuraet al.2006，Ozaki et al.2006，Ohta et al.(2007))、紅羅非魚(Oreochromisniloticus)(Lacerda 2010)、南亞野鯪(Labeorohita)(Panda 2011)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Okutsu 2007,Shikina 2008,2010)等物種上。但目前未發現達氏鱘精原細胞分離培養方法的相關報道。

達氏鱘精原細胞培養液是進行精原細胞長期培養的關鍵因素之一。本發明提供一種多種成分所組成的適用于達氏鱘精原細胞培養的培養液。這種培養液不含胎牛血清，能夠實現達氏鱘精原細胞的長期培養。本發明的培養液可用來建立達氏鱘精原細胞系，用于長期培養達氏鱘精原細胞。本發明還涉及所述的精原細胞培養液在長期保存達氏鱘精原細胞中的用途。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種達氏鱘精原細胞培養液。該培養液特異性的針對精原細胞的培養，使得達氏鱘原代精原細胞在體外生長更容易增殖，為達氏鱘生殖發育研究提供有效的細胞平臺。

本發明還有一個目的是提供了一種達氏鱘精原細胞培養液在培養精原細胞中的應用。