[發明專利]一種硫巰化多肽的富集方法

有效

• 申請號: 201510902151.0
• 申請日: 2015-12-09
• 公開（公告）號: CN106854231B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 張麗華;袁輝明;朱旭東;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K1/16
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種硫巰化多肽富集方法及應用，以多氨基樹枝狀聚合物為載體，通過共價修飾碘乙酸?N?琥珀酰胺酯，制備成選擇性與含巰基多肽反應的水溶性高分子化合物，通過將該化合物與蛋白質酶解產物充分混合，并置于超濾膜上，在高速離心下，選擇性將含巰基多肽截留在膜上，最后在膜上加入二硫鍵還原劑在一定溫度下選擇性將硫巰化多肽從高分子化合物上釋放，通過高速離心，即獲得硫巰化多肽。該方法具有操作簡單、通量高，選擇性好等優點，應用于復雜蛋白質組樣品中規?；驇€化修飾多肽的富集。

技術領域

本發明涉及一種硫巰化多肽富集方法及其在細胞、組織及體液等蛋白質組樣品中規模化硫巰化多肽分析中的應用。

背景技術

大量研究結果表明，氧化應激在衰老相關多種重大疾病中都扮演了關鍵的病理角色?；钚匝?ROS)、活性氮(RNS)通過攻擊脂質大分子、蛋白質分子和DNA分子等，引起細胞生理功能的紊亂，進一步導致細胞凋亡和壞死。蛋白質的含硫氨基酸殘基，包括半胱氨酸(cysteine，Cys)殘基和蛋氨酸(methionine，Met)殘基，都是活性氧發揮氧化-還原調節的重要作用位點?；钚匝踅Y合到這些氨基酸殘基上以后，產生一種氧化-還原依賴的翻譯后修飾，改變蛋白分子的結構和功能，從而進一步引起各種生物學效應。最近，硫巰化修飾是作為蛋白質半胱氨酸殘基上一種新的氧化修飾得到廣泛關注。目前，硫巰化修飾的富集主要集中在蛋白質水平上，尚未有大規模的組學富集方法(Angew.Chem.Int.Ed,2014,53,575-581；Sci.Signaling,2009,2,ra72)。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種可用于復雜蛋白質組樣品中規?；患驇€化多肽的方法。為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1)多氨基樹枝狀聚合物、甲醇、磷酸緩沖鹽、以及碘乙酸-N-琥珀酰胺酯充分混合后，避光振蕩反應0.5-24小時；

其中碘乙酸-N-琥珀酰胺酯加入摩爾量為多氨基樹枝狀聚合物的1-100倍，甲醇加入量為總體積的50％-80％，磷酸緩沖鹽濃度為0.01-0.5M,pH為7-9，多氨基樹枝狀聚合物為以1,4-丁二胺為核心的氨基乙醇樹枝狀聚合物中的一種或二種以上，分子量范圍為30000Da-100000Da。

2)制備的水溶性高分子化合物與蛋白質酶解產物充分混合后，室溫避光振蕩反應0.5-24小時，形成水溶性高分子-巰基多肽復合物。

其中蛋白質酶解產物加入量為水溶性高分子化合物的0.1-1倍；

3)超濾膜的截留分子量為3000Da至10000Da；使用超濾膜的離心轉速為5000rpm至20000rpm。

4)二硫鍵還原劑為巰基乙醇、二硫蘇糖醇、磷酸三氯乙酯。

其中二硫鍵還原劑加入摩爾量為蛋白質酶解產物摩爾量的0.5％-2％；

5)二硫鍵還原劑25℃-90℃溫度下反應0.5-3小時，斷裂硫巰化多肽上的二硫鍵，進而釋放出多肽。

6)該硫巰化多肽富集方法應用于細胞、組織及體液等蛋白質組樣品中規?；驇€化多肽的富集。

本發明具有如下優點：

1、采用多氨基樹枝狀聚合物，可提供多個活性反應位點，提高巰基多肽的鍵合量；

2、采用超濾膜截留的方式，操作簡單快速、適用面廣；

3、發展的硫巰化多肽富集方法可用于復雜蛋白質組樣品中規模化硫巰化多肽的富集方法。

附圖說明

圖1為可選擇性與含巰基多肽反應的水溶性高分子化合物的合成示意圖(a)及硫巰化多肽富集流程圖(b)；

圖2為巰基肽段富集性能評價(a)為富集前，(b)為富集后；