[發明專利]鑒定柱花草雜交后代真實性的多重PCR引物、方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510899711.1
• 申請日: 2015-12-08
• 公開（公告）號: CN105296667A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 黃春瓊;劉國道;白昌軍
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;陳歡

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鑒定柱花草雜交后代真實性的多重PCR引物、方法及試劑盒。

背景技術

統作物育種過程主要依賴于植株的表型選擇(phenotypicselection)，性狀選擇效果難以提高。遺傳標記特別是基于DNA多態性的分子標記在作物遺傳連鎖圖譜構建、重要性狀基因標記定位與克隆、種質資源遺傳多樣性與系統發育分析、品種指紋圖譜繪制及遺傳純度檢測等方面廣泛應用，尤其是分子標記輔助選擇(molecularmarker-assistedselection,MAS)為育種工作提供了極大方便，可顯著提高育種的選擇效率與育種預見性。

目前，隨著分子標記技術的不斷發展和廣泛應用，國內外在植物雜交育種的后代鑒定中也越來越多地應用各種分子標記技術，如RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子標記。但RAPD標記受反應條件的影響較大，重復性差；SSR單個標記提供的信息量較少，引物具有物種特異性，開發難度也大，成本較高；ISSR標記的擴增條件需要較長時間的摸索，且多為共顯性標記；AFLP標記操作復雜，要求嚴格，成本高等不足之處。

一種基于PCR的新型分子標記技術一SRAP(Sequence-relatedAmplifiedPolymorphism)標記的發明和應用彌補了以上分子標記的不足且具備了它們的優點。此技術是由美國加里弗尼亞大學，蔬菜系Li和Quiros于2001年在蕓薹屬植物中開發提出的。SRAP標記是根據基因外顯子中豐富的GC含量和內含子、啟動子中豐富的TA含量的特點，利用獨特的引物設計對ORFs(Openreadingframes,開放閱讀框架)進行擴增，因不同個體間的外顯子、內含子和啟動子的不同而產生多態性。SRAP標記簡單、穩定可靠、重復性好、多態性高、在基因組中分布均勻、引物非特異性、少量引物可組配多種引物對等優點使其在多種植物中得到廣泛的應用。引物大小和引物組合是成功進行SRAP分析的關鍵。

目前，多數報道均采用單一SRAP引物對檢測柱花草屬植物雜交后代的真實性，這導致每次實驗都需要配置不同的體系進行PCR，比如要鑒定100種雜交后代，就要配置至少100個PCR管，由于鑒定引物不同，DNA樣品不同，在配置PCR體系過程中非常麻煩，很容易加錯樣品。若提供一種引物組合物，同時可以用于鑒定多種雜交后代真實性，只需要配置一個PCR體系，再分別添加待檢測的雜交后代真DNA，將大大降低工作量，減少人為失誤。

因此，需要提供一種同時采用多對SRAP引物對鑒定柱花草屬植物雜交后代的方案；目前，還未有報道用于鑒定柱花草屬植物雜交后代真實性的多重PCR引物。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種鑒定柱花草雜交后代真實性的多重PCR引物、方法及試劑盒。本發明提供的柱花草雜交后代真實性的分子鑒定方法，為針對柱花草雜交后代進行SRAP分子標記鑒定，快速、準確。

第一方面，本發明提供了一種鑒定柱花草雜交后代真實性的多重PCR引物，包括如下a)-d)引物對的兩對或三對：

a).引物對Me1Em8:

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’，反向引物5'-GACTGCGTACGAATTCAA-3'；

b).引物對Me3Em3:

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGAAT-3’，反向引物5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'；

b).引物對Me4Em2:

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGACC-3’，反向引物5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3'。

第二方面，本發明還提供了一種鑒定柱花草雜交后代真實性的多重PCR方法，為用如第一方面所述的多重PCR引物擴增待鑒定的柱花草雜交后代的基因組DNA，其中，多重PCR體系中，DNA模板用量為50-200ng、Mg²⁺濃度為2.8mmol/L、引物總濃度為0.9μmol/L(每對引物各0.2μmol/L，每條引物等量添加)、dNTP濃度為0.25mmol/L、Taq酶用量為1U。

優選地，多重PCR擴增反應條件為：

第三方面，本發明還提供了一種鑒定柱花草雜交后代真實性的試劑盒，包括如第一方面所述的多重PCR引物，還包括用于多重PCR的緩沖液、DNA聚合酶。