[發明專利]一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞成像方法

有效

• 申請號: 201510880751.1
• 申請日: 2015-12-04
• 公開（公告）號: CN105548097B
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 曾晞;朱勤;牟蘭;吳玉田;曾莉;張紅
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07D215/26;C09K11/06
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002
• 代理人: 徐逸心;袁慶云

1.一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羥基苯基)乙烯基-8-羥基喹啉，簡稱探針，作為極端pH值下的活性細胞熒光成像探針，其結構式為：

方法是：(1)用探針乙腈溶液和緩沖溶液配制pH在2～4范圍的探針溶液，再將探針與活性細胞孵化后，用熒光顯微鏡檢測，呈現清晰的綠色熒光細胞圖像，隨pH值的增大，細胞的綠色熒光減弱；(2)用探針乙腈溶液和緩沖溶液配制pH在10～12范圍的探針溶液，再將探針溶液與活性細胞孵化后，用熒光顯微鏡檢測，呈現清晰的紅色熒光細胞圖像，隨pH值的增大，細胞的紅色熒光增強；(3)用探針乙腈溶液和緩沖溶液配制pH在5～9范圍的探針溶液，再將探針與活性細胞孵化后，熒光顯微鏡檢測不到細胞的熒光圖像；上述所指極端pH值是指pH2～4、pH10～12。

2.根據權利要求1所述的一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是用乙腈和緩沖溶液配制探針溶液的方法為：(1)用乙腈溶解探針試劑，配成探針濃度100μM的乙腈溶液；用濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷和50mM的HCl溶液，用pH計調節，配成pH＝2～9的不同pH值的緩沖溶液；取濃度為100μM的探針乙腈溶液100μL，加三羥甲基氨基甲烷HCl緩沖溶液900μL，配制成pH＝2～9的不同pH值的探針溶液；(2)用乙腈溶解探針試劑，配成探針濃度100μM的乙腈溶液；用濃度為50mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和50mM的NaOH溶液，用pH計調節，配成pH＝10～12的不同pH值的緩沖溶液；取濃度為100μM的探針乙腈溶液100μL，加4-羥乙基哌嗪乙磺酸NaOH緩沖溶液900μL，配制成pH＝10～12的不同pH值的探針溶液。

3.根據權利要求1所述的一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是探針與活性細胞孵化的方法，是用人體前列腺癌細胞PC3，經復蘇接種于含10％胎牛血清以及含1％雙抗的培養基中，培養基為改良型RPMI-1640，在溫度為37℃，5％CO₂以及飽和濕度為100％的培養箱中培養，每隔2-3天傳代1次，選擇生長狀態良好的細胞接種于12孔板中培養，密度為2×10⁴個/ml，次日用新鮮培養基清洗細胞兩次，將細胞分別浸入含不同pH值的探針培養液中，在培養箱中孵育，使不同pH值的緩沖溶液配制的探針對細胞染色，吸出含探針的培養液，用新鮮培養基清洗細胞，然后用熒光顯微鏡檢測。

4.根據權利要求1所述的一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是探針與細胞的孵化過程中，控制探針的濃度在10～100μM范圍，探針能很好滲透到活體PC3細胞內，細胞呈圓潤飽滿狀，探針與細胞具有良好的相容性，探針與細胞的孵化時間在20～30min內未見細胞凋亡，探針對細胞無毒性；熒光顯微鏡檢測時，在pH為2～4的范圍，用熒光顯微鏡的綠色通道，激發波長為450～490nm檢測，呈現清晰的綠色熒光細胞圖像；在pH為10～12的范圍，用熒光顯微鏡的紅色通道，激發波長為510～550nm檢測，呈現清晰的紅色熒光細胞圖像；在pH為5～9的范圍，用熒光顯微鏡的紅色或綠色通道檢測，不顯現細胞圖像。

5.根據權利要求1或2或3所述的一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是所用的試劑為分析純或生化試劑，所用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活性PC3細胞為人體前列腺癌細胞；所用的拍照設備為熒光倒置顯微鏡。

6.根據權利要求1或2或3所述的一種利用熒光探針在極端pH值下的活性細胞熒光成像方法，其特征是利用所述探針的熒光成像方法對活性細胞內pH檢測：活性PC3細胞經復蘇、傳代、接種、培養、清洗后，將細胞分別浸入pH為3.6或pH為10.6的50mM緩沖溶液中，在37℃，5％CO₂以及飽和濕度為100％的培養箱中孵育5～10min，吸出含不同pH值的緩沖溶液，用新鮮培養基清洗細胞3次；用熒光顯微鏡檢測；再將上述細胞浸入含10μM探針的培養液中孵化1h，吸出含探針的培養液，用新鮮培養基清洗細胞3次，用熒光顯微鏡檢測；經pH為3.6的緩沖溶液孵化的細胞，觀察不到細胞的熒光圖像，該細胞再經探針孵化后，清晰地觀察到綠色熒光細胞圖像；經pH為10.6的緩沖溶液孵化的細胞，觀察不到細胞的熒光圖像，該細胞再經探針孵化后，清晰地觀察到紅色熒光細胞圖像。