[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗牙周病抗體的制備方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510873308.1
• 申請(qǐng)日: 2015-12-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105418758A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張國(guó)強(qiáng);李光宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 沈陽(yáng)惠民生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/12
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/12;C07K1/18;A61K39/40;A61K8/64;A61K8/36;A61K8/368;A61Q11/00;A61P1/02;A23G4/12;A23G1/42;A23G9/36
• 代理公司: 沈陽(yáng)利泰專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 21209
• 代理人: 劉忠達(dá)

1.一種抗牙周病菌抗體的制備方法，其特征在于包括下述步驟：

（1）取牙齦卟啉單胞菌，在BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)5-7天；將培養(yǎng)好的牙齦卟啉單胞菌進(jìn)行離心處理，收集菌體，用pH6-7、濃度為0.05-0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗滌菌體4-6次，50-65℃的溫度下，加熱25-35分鐘，進(jìn)行滅活處理，得到牙齦卟啉單胞菌液；

將牙齦卟啉單胞菌液和等量的福氏佐劑混合，用勻漿器處理，制得菌體佐劑抗原；

（2）、根據(jù)脯乳類(lèi)動(dòng)物種類(lèi)，每次取牙齦卟啉單胞菌抗原1-5ml，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行淋巴結(jié)和背部皮下多點(diǎn)注射，共注射三次，每次間隔三周；末次免疫后20天，經(jīng)檢測(cè)效價(jià)合格后采集血清，取免疫血清攪拌下加入適量鹽水稀釋?zhuān){(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5，加入等量飽和硫酸銨溶液，在2-8℃溫度下靜置20-30小時(shí)，高速離心20-30分鐘，取其沉淀，經(jīng)復(fù)融超濾濃縮除鹽、除菌后冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG粗提物；

（3）、將抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG粗提物離心純化后，再經(jīng)DEAE-SephadexA50層析柱純化；用含NaCl的磷酸緩沖液進(jìn)行連續(xù)或分段梯度洗脫，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集有抗體活性的蛋白洗脫液，調(diào)節(jié)蛋白含量為20mg/ml；

將前一步驟所得的蛋白洗脫液再經(jīng)SephadexG200凝膠柱層析純化，用含NaCl的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集有抗體活性的蛋白洗脫液，經(jīng)0.22μ膜過(guò)濾除菌，冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG純品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗牙周病菌抗體的制備方法，其特征在于離心純化的速度為5000-12500rpm，離心次數(shù)2-5次，DEAE陰離子交換層析法中，洗脫液磷酸緩沖液的濃度為0.003-0.02M，所含NaCl的濃度為0.03-0.1M，凝膠過(guò)濾柱層析洗脫液磷酸緩沖液濃度為0.01-0.2M，所含NaCl的濃度為0.1-0.5M；親和層析洗脫液濃度為0.1-0.5M。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種抗牙周病菌抗體的制備方法，其特征在于：

用BHI培養(yǎng)基，在37℃溫度厭氧條件下，靜置培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌5-7天，將培養(yǎng)后的牙齦卟啉單胞菌用4000rpm，離心10分鐘，收集菌體；用pH值為6.0、濃度為0.2M的磷酸緩沖生理鹽水洗菌體5次，50℃、25分鐘加熱滅活處理，制得牙齦卟啉單胞菌液；取20億/ml菌液，與等量的福氏佐劑混合，用勻漿器處理，制得牙齦卟啉單胞菌佐劑抗原；

根據(jù)哺乳動(dòng)物種類(lèi)，每次取菌體佐劑抗原1-5ml，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行淋巴結(jié)和皮下多點(diǎn)注射，共注射三次，每次間隔三周；

第三次免疫動(dòng)物后20天，檢測(cè)效價(jià)合格后，收集抗血清用鹽水稀釋?zhuān){(diào)節(jié)pH值至8.0，攪拌下加入等量飽和硫酸銨溶液置2-8℃靜置24小時(shí)，8000rpm離心20分鐘，取沉淀，經(jīng)超濾除鹽、濃縮、除菌后冷凍干燥，制得抗牙周病菌抗體IgG粗提物；

將抗牙周病菌抗體IgG粗提物經(jīng)DEAE-SephadexA50層析柱層析；柱床2.5×35cm，加入10mg/ml的樣3.0ml，用含0.07MNaCl的0.01M、pH7.0磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速20ml/h，洗脫液按每管5.0ml；收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集有抗體活性的蛋白洗脫液，調(diào)節(jié)蛋白含量為20mg/ml；繼而將該液進(jìn)一步經(jīng)SephadexG200凝膠柱層析；柱床2.0×65cm，加樣1.5ml，用含0.1MNaCl的0.01M、pH7.0磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速8.0ml/h，洗脫液按每管5.0ml，收集各蛋白洗脫峰，并以ELISA檢測(cè)各蛋白的抗體活性；收集有抗體活性的蛋白洗脫液，經(jīng)0.22μ膜過(guò)濾除菌，冷凍干燥，即得抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG純品。

4.用本發(fā)明方法制備的抗牙齦卟啉單胞菌抗體IgG的應(yīng)用，其特征在于：加入山梨酸鉀、苯甲酸鈉兩種抗菌劑中至少一種作為有效成份的防牙周病組合物，包括牙膏、口含液、漱口水和噴霧劑型的口腔用產(chǎn)品，或是口香糖、巧克力、雪糕、冰激凌食物，本發(fā)明抗體IgG的加入量為0.05-0.2%，山梨酸鉀、苯甲酸鈉的加入量為0.01-0.02%。