[發明專利]基于抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料

在審

• 申請號: 201510869834.0
• 申請日: 2015-12-02
• 公開（公告）號: CN105498705A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 許楊;熊勇華;何慶華;曹冬梅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: B01J20/24
• 分類號: B01J20/24;B01J20/281;B01J20/282;B01J20/28;B01J20/30;B01D15/38;G01N33/53;G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術)的免疫親和 吸附材料，特別是針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料。

技術背景

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌產生的劇毒次 級代謝產物。它們的化學結構類似，為二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃 曲霉毒素B₁(AFB₁)、B₂(AFB₂)、G₁(AFG₁)、G₂(AFG₁)和M₁(AFM₁) 等。在天然污染的食品和飼料中，AFB₁的污染最為常見，其毒性和致癌性 也最強，被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。世界各國及 地區指定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準，例如歐盟嬰幼兒食品中AFB₁允 許量≤0.10μg/kg。

現有的黃曲霉毒素檢測方法主要有儀器分析法、免疫分析法以及薄層 層析法。其中儀器分析法具有靈敏度高、準確性和重復性好等優點，但是 對于分析樣品前處理要求較高，需要盡量去除樣品中的雜質以減少對后續 檢測的干擾。傳統的前處理方法有液相萃取、固相萃取等，處理過程繁瑣 且特異性不高。親和層析技術基于配基與待測物質之間特異性的識別，可 通過一步操作實現對復雜混合樣品中待測物的分離純化。目前使用的黃曲 霉毒素親和純化介質一般采用多克隆抗體或單克隆抗體作為配基，存在不 耐有機試劑、活性迅速降低的問題。因此，需要開發活性高、穩定性好的 新型配基替換傳統抗體。單域重鏈抗體是由羊駝重鏈抗體的可變區組成， 又稱為納米抗體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產等特性，相較于傳統 抗體具有明顯的優勢。

發明內容

本發明的目的是提供一種針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料及其 應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

針對黃曲霉毒素的免疫親和吸附材料包括載體和配基，所述配基為單 域重鏈抗體，具有SEQIDNO.：1所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別 黃曲霉毒素。

所述配基還可以為在前述單域重鏈抗體基礎上通過隨機或定點突變 技術進行改造所獲得的能與黃曲霉毒素特異性結合的抗體。

所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。

上述黃曲霉毒素免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：

所述載體為磁珠時，制備方法為：取1mg羧基磁珠于離心管中，加 入500～1000μl活化緩沖液(10mM，NaH₂PO₄，pH6.0)，渦旋混合均勻， 磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1～5mg碳二亞胺 (EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置30min。用偶 聯緩沖液(10mM，Na₂HPO₄，pH7.4)洗滌磁珠3遍，加入抗黃曲霉毒 素單域重鏈抗體，室溫反應2～6h，得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重 鏈抗體的免疫磁珠；

所述載體為瓊脂糖凝膠微球時，制備方法為：將CNBr活化的干膠用 0.1MHCl洗滌10～15次，每次平衡5～10min。用偶聯緩沖液(10mM， Na₂HPO₄，pH7.4)洗滌5～15次，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，室 溫反應2～10h，得到共價偶聯了抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和 吸附材料；

所述載體為硅膠微球時，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖 液(PBS，10mM，pH6.0)交替洗滌5～10次，用PBS緩沖液懸浮硅膠微 球，加入抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度1～10mg/ml的碳 二亞胺(EDC)，迅速混勻，4℃攪拌反應12～24h，得到共價偶聯了抗黃 曲霉毒素單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。

將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填 至層析柱，即得到黃曲霉毒素免疫親和層析柱，方法為：根據層析柱容量， 取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱，加入5～10倍柱床體積的PBS(10 mM，pH7.4)洗滌后，4℃，保存于20％乙醇溶液。