[發明專利]一種基于基因測序法的HLA-B27基因分型的方法

在審

• 申請號: 201510868927.1
• 申請日: 2015-12-01
• 公開（公告）號: CN105296481A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 馮振;景葉松;弭兆元
• 申請（專利權）人: 濟南英盛生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于基因測序法的HLA-B27基因分型的方法。

背景技術

近年來研究HLA與疾病相關性的資料表明，某些疾病的發生率與一些特殊型別的HLA檢出率有關，這些病人大多是發病機理不明并伴有免疫功能異常和有遺傳傾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表達情況不僅有助于了解發病機理，對于疾病的診斷、預防和預后判斷都有重要意義。

HLA-B27基因屬于Ⅰ型MHC基因，基本上表達在機體中所有有核的細胞上，尤其是淋巴細胞的表面有豐富的含量。早在二十多年前，人們就已發現HLA-B27抗原的表達與強直性脊柱炎有高度相關性，超過90％的強直性脊柱炎患者其HLA-B27抗原表達為陽性，普通人群中僅5-10％的為陽性，而強直性脊柱炎由于癥狀與許多疾病相似而難以確診，因此HLA-B27的檢測在疾病的診斷中有著重要意義。

強直性脊柱炎(AS)是一種以骶髂關節和中軸關節慢性炎癥為主的、原因不明的自身免疫性疾病，以侵犯脊柱為主，早期表現為滑膜炎和韌帶附著點的病變，晚期由于韌帶鈣化造成脊柱強直，目前本病的發病原因和致病機制尚未完全明確。患者早期癥狀與腰椎間盤突出癥、骶髂關節炎、腰背肌筋膜炎等相似，在X線片上沒有骶髂關節炎的明確表現，因此在臨床診斷上容易混淆而致誤診，延誤病情早期治療，失去最佳治療時機，導致中、晚期不可逆癥狀出現，最終發生關節強直甚至致殘。賴建銘等通過對AS家系調查發現，HLA-B27陽性的幼年AS患者中69％有脊柱關節病家族史，其中90％為一級親屬，顯示AS有明顯的家族聚集性，說明AS的危害性很大。因此，早期診斷對控制患者病情發展、減輕畸形、維持和改善功能，具有相當重要的意義。應盡可能地在肯定的放射學骶髂關節炎出現之前進行診斷。在脊柱性關節病這一類的疾病中除了強直性脊柱炎以外，還有許多其它的疾病與HLA-B27抗原的表達有著或多或少的相關性，因此HLA-B27的檢測在這些疾病的診斷中是一個非常有價值的指標。

文獻報道指出，①HLA-B27陰性和陽性患者男性發病率明顯高于女性，陰性與同性別陽性患者平均發病年齡明顯偏晚；②HLA-B27陰性患者以31～45歲為主，陽性患者以16～30歲為主；③HLA-B27陰性和陽性患者首發癥狀均以中軸關節炎和外周關節炎為主。陰性和陽性患者主要臨床表現上均以出現下腰疼痛，髖部疼痛為主。陰性患者出現全身癥狀(包括發熱、盜汗和乏力)明顯少于陽性患者。總之，HLA-B27陰性患者比同性別陽性患者平均發病年齡明顯偏晚，部分陰性患者病情相對較輕。HLA-B27陰性和陽性患者發病上的差異在對HLA-B27檢測陰性的疑似患者診斷中應得到重視。

目前可用于檢測HLA-B27的方法有流式細胞法、ELISA法、PCR-SSP法、測序法、熒光PCR法等，但這些方法都存在不同程度的缺點。流式細胞法要求標本新鮮，不能長期保存，因此不利于進行實驗室間質量評價；且該方法原理基于抗原抗體結合反應，而HLA-B27的單克隆抗體會與其它HLA-B等位基因產物發生不同程度的交叉反應，出現假陽性結果。ELISA法成本低，結果數據客觀，但操作復雜，影響反應因素較多，結果準確性差，且固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此每次測定均需作標準曲線。PCR-SSP法需要凝膠電泳，多用于科研無法在醫院推廣。測序法最為準確，通常檢測分析周期稍長，分析樣本較多時，若無前期篩選(陽性結果的初步篩選)，其工作量較大，且往往需要重復確認(當擴增不出結果時需要仔細分析確認擴增條件和擴增結果)；熒光PCR方法，采用熒光染料對擴增的特異片段產生信號，通常擴增片段較小，無法進一步對HLA-B27進行分型。

雖然上述方法在臨床HLA-B27檢測上扮演著重要角色，但卻各有其缺陷，一種操作簡便、快速、且準確度高的檢測方法的開發將起到關鍵性臨床作用。目前尚無文獻報道利用熒光PCR結合基因測序技術檢測HLA-B27不同基因亞型的方法。

發明內容

為解決現有技術針對HLA-B27基因進行檢測分型中存在的技術問題，本發明提供一種能夠快速、靈敏、特異的對HLA-B27基因進行分型的方法。