[發明專利]用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應用

有效

• 申請號: 201510860782.0
• 申請日: 2015-11-30
• 公開（公告）號: CN105316419B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 吳濤;侯永清;趙迪;丁斌鷹;易丹;王蕾;陳洪波
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩;王敏鋒

本發明公開了用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應用，通過對已經報道的糞腸球菌基因組序列的比對分析，本發明提供了用于糞腸球菌定性定量檢測的引物5’?CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA?3’、5’?CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC?3’，同時本發明提供了一種飼料樣品的預處理方法，使得飼料中的益生菌可以充分釋放，準確真實的反應出飼料中的益生菌數目。本發明可以在不進行益生菌純培養的基礎上，簡便、快速、準確地定性、定量檢測豬飼料中糞腸球菌，檢測程序簡單、檢測效率高、準確性好，靈敏度高，重復性好。

技術領域

本發明屬于畜牧獸醫技術領域。更具體地，本發明涉及用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒及檢測方法和應用。

背景技術

隨著我國動物飼料中抗生素的禁用，新型的綠色添加劑的開發成為熱點。目前益生菌制劑不斷發展，但是在其定性、定量檢測的方法還不夠科學和快速，這在一定程度上限制了益生菌制劑的發展。通常采用生理生化反應和選擇性培養基純培養分離計數的傳統方法，極易因為菌種差異導致的檢測效率受限、檢測結果不穩定，除此之外，傳統方法也會耗費大量的時間和資源。實時熒光定量PCR相對于PCR技術來說，是定性到定量的飛躍，因其特異性強、重復性好、準確和高效的特點成為分子生物學和微生物學領域非常重要的定量檢測方法。通過種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR技術，建立豬飼料中糞腸球菌的快速定性、定量檢測方法，可以提高檢測效率、簡化檢測程序，并促進飼料行業和養殖業的發展，為益生菌和飼料產業的快速和長遠發展提供技術保障。

本申請針對豬飼料中含有的糞腸球菌，通過對已經報道的糞腸球菌基因組序列的比對分析，選取糞腸球菌的保守基因作為目的基因，自行設計糞腸球菌的基因序列的種屬特異性引物，利用該引物進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立了豬飼料中糞腸球菌的快速定性和定量測定方法。

發明內容

用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒，包括引物：5’-CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。

本發明的另一個目的在于提供了用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，方法簡單，重復性高，結果準確。

本發明的另一個目的在于提供了一種用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒，包括引物：5’-CGTCCAAGTTATTTCCCCTTCA-3’、5’-CCAGCACCTAATACTTCAATCCAAC-3’。

用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的檢測方法，包括飼料樣品預處理的方法，該方法包括：

經過充分粉碎混勻的飼料25g與225mL的滅菌生理鹽水混合，在4℃以100轉/分的速度震蕩1-2h，配成10％的均勻稀釋液。對均勻稀釋液進行10倍遞增稀釋，選擇2個以上適宜的稀釋度，根據需要，提取細菌基因組DNA或RNA。

用于飼料中添加的糞腸球菌的快速定性、定量檢測試劑盒的應用，其應用包括利用該試劑盒制備成用于糞腸球菌的檢測試劑，或利用該試劑盒進行糞腸球菌的定性檢測，或利用該試劑盒進行糞腸球菌的定量檢測，或利用該試劑盒同時進行糞腸球菌的定性和定量的檢測。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

(1)本發明所采用的飼料樣本的處理方法使得在益生菌的提取過程中，益生菌的擴增有限，同時飼料中的益生菌又可以充分釋放，這樣所測得值才能真實的反應出飼料中的益生菌數目，為一種特異的適用于飼料中糞腸球菌提取方法，為本發明首創。