[發(fā)明專利]一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測試劑盒

在審

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• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105349660A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設計）人: 戴立忠;楊幫林;李勃;鄧中平
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京弘權知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

技術領域

本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測試劑盒，具體涉及一種熒光定量PCR沙眼衣原體/解脲脲原體核酸檢測試劑盒。

背景技術

沙眼衣原體(CT)是一種具有獨特發(fā)育周期、嚴格細胞內寄生的原核細胞型微生物，是一類介于病毒、細菌和立克次體之間的特殊微生物，在微生物分類上屬于細菌門、立克次體綱、衣原體目及衣原體屬。是國內外最常見的性病病原體之一，在我國生殖道衣原體感染居STD的第三位，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢。機體感染CT后，能誘導產(chǎn)生型特異性細胞免疫和體液免疫，但通常免疫力不強，且維持短暫，因而常造成持續(xù)感染、隱性感染和反復感染。

解脲脲原體又稱解脲支原體(UU)，屬于柔膜綱支原體目支原體科的脲原體屬，是一類介于細菌與病毒之間的最小原核微生物，主要分布于人體泌尿生殖道內，并通過性接觸而傳播，也可由母體垂直傳染給胎兒。男性生殖道最常見的寄生處在尿道口和精液中，女性生殖道最常見的寄生處在陰道。解脲脲原體是非淋菌性尿道炎的主要病原體之一，感染后可導致多種生殖道炎癥。在男性，可導致非淋菌性尿道炎、急性附睪炎、前列腺炎等的發(fā)生；在女性可引起包括子宮內膜炎、輸卵管炎、卵巢炎等，宮內感染可引起流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)等不良后果。

目前沙眼衣原體和解脲脲原體的診斷方法主要有培養(yǎng)法和免疫學方法，其中，培養(yǎng)法的特異性和敏感性高，但臨床檢測時間過長(至少需要24h-48h，甚至更長時間)，過程繁瑣，需要使用特殊的培養(yǎng)介質以及易受雜菌影響，不適用于大范圍檢測。免疫學方法簡便快捷，但特異性差、靈敏度不高。近年來，聚核酶鏈式反應(PCR)法漸漸顯現(xiàn)了其在檢測上的優(yōu)勢，標準PCR過程分為三步：DNA變性(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；退火(60℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈；延伸(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，最終合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

運用PCR技術檢測主要涉及到兩個方面：核酸的提取和核酸的擴增檢測。

目前，國內臨床上主要采用煮沸法對沙眼衣原體和解脲脲原體的核酸進行提?。合葘⒎置谖飿颖緷饪s、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。煮沸法具有諸多不足之處：1)核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，經(jīng)過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導致樣本定量偏低，同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。2)檢測靈敏度不高，約在10000copies/ml左右；3)沒有設置陽性內對照(即內標)，無法監(jiān)控假陰性；4)一般沒有預防PCR產(chǎn)物污染的措施。另外，對于濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無法看到，看得到沉淀的是因為將病毒與蛋白都濃縮了，這樣，導致后面加入裂解液時很難充分混勻；無法看到沉淀，使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到病毒核酸。