[發明專利]一種甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201510848892.5
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105349699A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 戴立忠;范文洲;陳曉亮
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

1.一種甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒包括RNA提取溶液和PCR反應液，其中，所述RNA提取溶液包括：

RNA提取溶液I：由質量/體積比為0.2％～1.0％的十二烷基硫酸鈉、體積/體積比為1.0％～4.0％的曲拉通、0.2mol/L～1.0mol/L的異硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠組成；

RNA提取溶液II：100～300mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和100～300mmol/L、pH6.5±0.2的氯化鈉；

RNA提取溶液III：體積/體積比為0.1％～1.0％的曲拉通和100～300mmol/L的氯化鈉；

RNA提取溶液IV：礦物油；

所述PCR反應液包括：用于靶多核苷酸擴增的上游引物和下游引物以及用于靶多核苷酸檢測的探針。

2.根據權利要求1所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸檢測的探針序列分別為：

H基因探針：5’-FAM-CTATCTACAAGGCTCCCATTGTAAATGAAGCT-BHQ1-3’；

N基因探針：5’-FAM-CTCATAGCGTCTTGCATGCCTTTAGC-BHQ1-3’。

3.根據權利要求2所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸擴增的上游引物和下游引物序列分別為：

H基因上游引物：5'-GGCTGCATGTTTGTATAACGG-3'；

H基因下游引物：5'-CGCATTCTGACTCCTGGGT-3'；

N基因上游引物：5'-GTTGTCTTATAGCATTGGTGCC-3'；

N基因下游引物：5'-TCGGTTAAAGCCAATTGAGC-3'。

4.根據權利要求1所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括內標，所述內標序列為：

5'-AGTCTAGGTCATCTGATCCGTTTAGGGAAGCAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGGAAGTCTCATGGATGGACAAAGGGCGAACTTACA-3'。

5.根據權利要求4所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括用于內標核苷酸擴增的上游引物和下游引物以及用于內標核苷酸檢測的探針，且所述用于內標核苷酸檢測的探針序列為：

5'-CAATGACAGACGCCTTCCATGGTAATAGGG-3'。

6.根據權利要求1所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括RT-PCR增強劑，所述RT-PCR增強劑為濃度為100～500mmol/L的Mn(OAc)₂。

7.根據權利要求6所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包括0.8～1.2mol/L的Tris-HCl和0.1～1.0mol/L的EDTA。

8.根據權利要求7所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

9.根據權利要求1所述的甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒，其特征在于，所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒還包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

10.一種權利要求6-9中任意一項所述甲型流感H3N2型熒光PCR診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用步驟包括：

S01：取1200μl～1ml/人份的RNA提取溶液I和1μl/人份的內標，混和均勻并形成RNA提取試劑I-mix，瞬時離心后備用；

S02：根據待測樣本、陰性對照和陽性對照的數量，按39μl/人份的PCR反應液和1μl/人份的Mn²⁺溶液的比例取相應量的PCR反應液及酶混合液，充分混勻成PCR-mix，瞬時離心后備用；

S03：每管加入200μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待測樣本，蓋上管蓋，震蕩混勻10秒鐘，瞬時離心；

S04：每管加入50μl～400μlRNA提取溶液II，震蕩混勻10秒鐘后，室溫靜置10～30分鐘；

S05：靜置結束后瞬時離心，將離心管置于磁珠分離器上，2～5分鐘后緩慢將溶液吸出；

S06：每管加入400μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～500μlRNA提取溶液IV，震蕩混勻3～7秒鐘，瞬時離心后將離心管再次置于分離器上；

S07：2～5分鐘后，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液體完全吸出丟棄，靜置1～3分鐘后，將管底殘余液體完全吸出丟棄；

S08：加入10μl～100ulRNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻3～4次，室溫靜置5～30分鐘后將離心管再次置于分離器上2～5分鐘，然后將洗脫下來的RNA吸至新的1.5ml滅菌離心管中；

S09：根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量，每個反應管加入40μlPCR-mix，吸取已處理的樣本RNA、陰性對照、陽性對照按每個反應液點樣5μl加入3種PCR-mix中，蓋好管蓋，形成待測樣品；

S10：將待測樣品放置在熒光定量PCR擴增儀上進行測試。