[發明專利]一種比酶活提高的堿性果膠酶突變體

在審

• 申請號: 201510848522.1
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105316311A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發明（設計）人: 劉松;陳堅;堵國成;趙偉欣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;A23L33/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

技術領域

本發明涉及一種比酶活提高的堿性果膠酶突變體，屬于酶工程領域。

背景技術

果膠酶是一種復合酶，能夠將果膠聚合物分解成不飽和寡聚半乳糖醛酸。該酶分布廣泛，在部分寄生線蟲、植物和微生物內都有發現。果膠酶應用廣泛，已有40多年的工業應用史。根據最適反應pH的不同將果膠酶分為酸性果膠酶和堿性果膠酶PGL。其中酸性果膠酶主要應用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果實脫皮等方面。PGL應用主要應用于紡織、食品、造紙行業和環境領域。應用酶法作用上述領域相關反應具有環保、節約原料耗材和反應條件溫和等優點。然而目前對PGL進行分子改造研究較少，進行商品化的PGL也很少。

目前對堿性果膠酶研究比較深入的菌株主要是畢赤酵母、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。綜合比較可表達堿性果膠酶的不同宿主，畢赤酵母雖然表達蛋白易于純化，產量高，但發酵周期長、過程復雜、低溫誘導耗能高；枯草芽孢桿菌不易表達或表達酶活低等缺點。

發明內容

為了解決上述問題，本發明以前期研究的在PGL蛋白N端以PT-Linker連接一段正負電荷交替(親疏水性交替)的雙親短肽(AEAEAKAKAEAEAKAK，即SEQIDNO.3)，簡稱PGL-S1，為出發序列，對其進行進一步分子改造，將其中的雙親短肽S1的重復單元進行有序截短，截短至S1-1(AEAEAKAK，即SEQIDNO.4)，比酶活提高5.7倍。

本發明提供了一種比酶活提高的堿性果膠酶突變體，其氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列，突變體簡稱PGL-S1-1。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是將原有融合蛋白的短肽序列進行優化改造。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是原有融合雙親短肽的堿性果膠酶的雙親短肽進行有序截短。

本發明還提供一種表達所述突變體的基因工程菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基于工程菌為大腸桿菌。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以大腸桿菌為宿主、pET-22b(+)為載體，表達堿性果膠酶突變體。

本發明還要求保護編碼所述突變體的核苷酸序列，以及所述突變體和基因工程菌在食品、紡織或造紙方面的應用。

有益效果：相對于現有的突變體PGL-S1而言，本發明的突變體PGL-S1-1的比酶活提高了5.7倍，而且熱穩定性沒有受到影響，在60℃的半衰期及Tm值沒有改變。本發明的堿性果膠酶可在堿性條件下催化通過反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷鍵裂解，廣泛應用于食品、紡織和造紙等行業。

具體實施方式：

培養基：

種子培養基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，葡萄糖2g/L。

發酵培養基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH₂PO₄2.32g/L、K₂HPO₄16.43g/L。

堿性果膠酶酶活測定：

采用分光光度法測定。單位酶活定義：單位時間裂解聚半乳糖醛酸產生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活測定條件為：酶活力檢測：發酵液8000rpm離心10min，胞外PGL即包含于發酵上清液之中，取一定量做檢測。PGL反應體系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2mol·L^-1，0.44mmol·L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，待測樣品20μL，無活性的酶液為空白對照。PGL反應條件為：將反應體系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L^-1)終止反應，在235nm處測定吸光度值。

實施例1：突變菌株的獲得

采用PCR擴增或者化學合成的方法，得到氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的堿性果膠酶基因，然后將基因連接到pET-22b(+)，再轉化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，篩選，正確的轉化子命名為重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+)/PGL-S1-1)。

實施例2：突變株的驗證