[發明專利]病原生物的多種分析檢測

在審

• 申請號: 201510837509.6
• 申請日: 2003-12-02
• 公開（公告）號: CN105349657A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: G.哈伯豪森;T.埃姆里希;G.薩納;M.莫茨科;G.施米茨-阿赫吉安
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;石克虎

本申請是國際申請日為2003年12月2日的國際申請PCT/EP2003/013530進入中國、申請號為200380105073.7的題為“病原生物的多種分析檢測”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及檢測病原微生物的技術領域。更具體地，本發明涉及通過從所述病原生物擴增和檢測特定核酸序列檢測臨床樣品中病原生物導致的感染的領域。

背景技術

病原細菌，尤其導致膿毒的病原細菌的感染主要發生在醫院的重病監護室(ICU)并且是嚴重的。感染患者的細菌在多數情況下是未知的并且不能從癥狀確定。每種細菌需要施用特定抗生素的不同療法。目前，在常規診斷中，使用包括用血液或其他體液樣品培養細菌(如果存在)來檢測病原細菌，尤其革蘭氏陽性細菌。這種培養保持在有利于細菌生長的條件下約3天。在該期間內，細菌的數目從而它們的核酸增加。之后，將培養基裂解。裂解混合物用作隨后生化或免疫學分析的樣品。整個方法花費至少約4天直到清楚病原細菌對樣品造成的感染。病原細菌的感染對于受感染的人是非常嚴重的。在感染的第一天，必須開始治療，該治療優選施用適于特別影響具體感染細菌的抗生素。否則，患者受該感染的侵襲太嚴重而可能在弄清該感染之前死亡。另一方面，同時施用幾種廣譜抗生素以防止全身性事件必須避免使患者虛弱。因此當前的方法對于常規ICU診斷是不能令人滿意的。

很久以來，在本領域中已經公知通過基于核酸的雜交使用特定雜交探針鑒定病原生物如病原細菌或真菌。例如，EP0131052公開了方法和探針，其中直接從培養基檢測生物的某些種類或某一群體的核糖體核糖核酸(rRNA)序列。檢測核糖體靶序列特別有用，因為這些序列在體內擴增，導致各自測定的高度靈敏性。

利用PCR技術改進了對病原生物的基于核酸序列的檢測。對于病原真菌如念珠菌(Candida)和曲霉菌(Aspergillus)的檢測，例如，WO97/07238公開了一種方法，該方法使用一般性引物擴增所有類型的真菌核糖體18SrDNA序列并隨后將其與真菌種類特異的探針雜交。

作為分析核糖體基因序列的備選方案，非編碼但是轉錄的核糖體間隔區DNA序列，像位于16S和23SrRNA基因之間的ITS-1區已經被用于檢測和鑒定一些病原生物(見，例如，EP0452596)。

在另一背景中，通過與等位基因特異的擴增方法相當的依賴靶標的擴增區分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌組(Klausegger，A.，等人，J.Clin.Microbiol.37(1999)464-466)?；谒鼈兊?6Sr-DNA序列，Klausegger等人研究的種在16SrRNA基因的給定位置不同，因為所有研究的革蘭氏陰性細菌都在某一核苷酸位置含有一個G-殘基，而所有研究的革蘭氏陽性細菌在所述核苷酸位置總是含有一個C-殘基。因此，分別使用有差別的互補3’-末端C-殘基或互補G-殘基的引物，可以擴增革蘭氏陽性或革蘭氏陰性序列起源的DNA。

利用動態實時PCR得到了進一步發展。在這種類型的測定中，在每輪PCR中監視PCR產物的形成。通常在熱循環儀中測量擴增，該熱循環儀具有額外的檢測方法用以監視擴增反應期間的熒光信號。一個典型的實例是RocheDiagnosticsLightCyeler^TM(目錄號20110468)。在LightCycler^TM以及目前通過商業途徑可得到的其他實時PCR儀器中，通過熒光標記的雜交探針檢測擴增產物，這些探針僅當結合靶核酸時發出熒光信號，或者在一些情況中通過結合雙鏈DNA的熒光染料檢測擴增產物。為所要分析的所有反應確定限定的信號閾值，并且為靶核酸以及對照核酸如標準或管家基因確定達到該閾值所需的循環數(Cp)。可以基于為靶核酸和對照核酸所得到的Cp值確定靶分子的絕對或相對拷貝數(RocheDiagnosticsLightCycler^TM操作手冊(目錄號20110468))。

對于擴增DNA的檢測存在不同形式：

a)DNA結合染料形式

因為雙鏈擴增產物的量通常超過所要分析的樣品中最初存在的核酸的量，所以可以使用雙鏈DNA特異染料，當用適宜波長激發時該染料僅當結合雙鏈DNA時表現出增強的熒光。該方法在EP0512334中描述。優選地，僅使用像例如，GreenI的染料，它們不影響PCR反應的效率。本領域中公知的所有其他形式需要適當設計熒光標記的雜交探針，該探針僅當結合其靶核酸時發出熒光。

b)TaqMan^TM探針