[發(fā)明專利]一種桑樹青枯病鑒定的特異性引物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510831462.2
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105296479B
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴凡煒;唐翠明;羅國慶;王振江
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/689
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

本發(fā)明公開了一種桑樹青枯病鑒定的特異性引物，由上游引物RS?16S?F和下游引物RS?16S?R組成，所述上游引物RS?16S?F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物RS?16S?R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本發(fā)明還公開了一種利用上述引物早期快速鑒定桑樹青枯病的方法以及該引物在制備具有鑒定桑樹青枯病功能的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的桑樹青枯病鑒定的特異性引物，靈敏、高效、特異性好，本發(fā)明通過設(shè)計(jì)桑樹青枯菌16SrRNA的特異引物，結(jié)合熒光定量PCR的方法，在發(fā)病早期快速鑒定桑樹青枯病，為防治桑樹青枯病的發(fā)生提供可靠的依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于青枯病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種桑樹青枯病鑒定的特異性引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

桑樹青枯病是一種毀滅性土傳病害，其發(fā)病速度快，蔓延迅速，發(fā)病范圍廣，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病面積達(dá)90％以上，使得桑葉產(chǎn)量急劇下降直至絕收，給蠶農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。桑樹青枯病一旦爆發(fā)，防治非常困難。但在早期檢測出病害的發(fā)生，可以通過病株拔除、農(nóng)藥灌根、土壤消毒等方法有效預(yù)防青枯病的大面積爆發(fā)。

目前，對青枯病鑒定的方法主要有表型鑒定和培養(yǎng)基病原菌分離鑒定。表型鑒定即通過觀測桑葉和桑根的發(fā)病表型特征來判定青枯病的發(fā)生。由于植株病癥表型在發(fā)病中后期才能觀測到，而青枯病中后期防治比較困難，因此這種方法對青枯病的防治意義不大。培養(yǎng)基病原菌分離鑒定即利用TTC培養(yǎng)基分離病根木質(zhì)部中的病原菌，通過觀察病原菌形態(tài)鑒定青枯病的發(fā)生。這種方法能在較早期檢測青枯病的發(fā)生，但培養(yǎng)中易出現(xiàn)腸桿菌等雜菌污染，影響鑒定的準(zhǔn)確度。因此發(fā)明一種早期快速的桑樹青枯病鑒定方法，為桑樹青枯病早期診斷和防治提供理論基礎(chǔ)，對保障蠶桑產(chǎn)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種桑樹青枯病鑒定的特異性引物，該引物特異性強(qiáng)，快速、靈敏。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種早期快速鑒定桑樹青枯病的方法，該方法在發(fā)病早期能快速鑒定桑樹青枯病，為防治桑樹青枯病的發(fā)生提供可靠的依據(jù)。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述桑樹青枯病鑒定的特異性引物在制備具有鑒定桑樹青枯病功能的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種桑樹青枯病鑒定的特異性引物，由上游引物RS-16S-F和下游引物RS-16S-R組成，所述上游引物RS-16S-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，所述下游引物RS-16S-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中桑樹青枯菌的16SrRNA(GenBank ID：JX112350)序列特征，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)和篩選了上述桑樹青枯菌熒光PCR特異性引物(RS-16S-F:TGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGT如SEQ ID NO：1中所示/RS-16S-R:TCGAGCACCTAATGCATCTCTGCTTC，如SEQ ID NO：2中所示)。該引物對理論擴(kuò)增片段大小為197bp，該引物可由華大基因等公司合成。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種早期快速鑒定桑樹青枯病的方法，包括以下步驟：

(1)取疑似青枯病桑樹的根部，提取該桑樹根部的DNA；

(2)以該桑樹根部的DNA為模板，利用上述桑樹青枯病鑒定的特異性引物RS-16S-F/RS-16S-R進(jìn)行熒光定量qPCR；

(3)記錄該桑樹根部的DNA的qPCR反應(yīng)體系的Ct值，當(dāng)Ct值≤36時(shí)，表明有桑樹青枯菌的存在，該桑樹為發(fā)病植株；當(dāng)Ct值＞36時(shí)，表明沒有桑樹青枯病的存在，該桑樹為健康植株。

步驟(1)中優(yōu)選采用DNAiso reagent kit試劑盒提取桑樹根部的DNA。