[發明專利]一種獐芽菜苷鞘磷酸一胺醇受體拮抗劑的抗炎用途

在審

• 申請號: 201510828310.7
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105287615A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 嚴明;汪豪;高鵬;張陸勇
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: A61K31/7048
• 分類號: A61K31/7048;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及獐芽菜苷對鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的抗炎用途。

背景技術

S1P受體(sphingosine-1-phosphatereceptor，S1PR)是G蛋白偶聯受體家族成員之一，包括S1P1～S1P5，主要與G蛋白α亞型偶聯發揮作用。

炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應為炎癥。血管反應是炎癥過程的中心環節。炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以生于機體各部位的組織和各器官。急性炎癥平時具有紅、腫、熱、痛、機能掩藏等變化，同隨時常伴有發熱、白細胞增多等全身反應。是機體對于刺激的一種防御反應。

炎癥的產生實質上是機體與致炎因子進行抗爭的反映。這種分歧抗爭貫穿炎癥過程的始終。致炎因子作用于機體后，一方面引發組織細胞的損壞，使局部組織細胞顯現變性、壞死；另一方面，誘導機體抗病機能增加，以益于清除致炎因子，使受損組織得到修復，從而使機體的內環境以及內環境和外環境之間達到新的均衡。S1PR通過激活多條細胞內信號途徑發揮不同的生物學功能，包括調節細胞遷移、增殖、凋亡及細胞內鈣離子動員、炎癥因子和黏附分子表達，以及調控血管發生、血管緊張度和通透性等，進而對心血管系統發揮重要影響。S1P1廣泛表達于各種組織和細胞，在保持血管通透性等方面具有協調作用。

目前研究認為鞘氨醇-1-磷酸受體拮抗劑與多種細胞表面相應受體結合，在免疫調節方面具有促進淋巴細胞歸巢、抑制淋巴細胞外流，誘導淋巴細胞凋亡，并能影響樹突狀細胞及調節性T細胞功能另小鼠實驗顯示S1P1在血管重建、神經形成、免疫細胞遷移、內皮細胞屏障功能等方面發揮重要作用。所以建立S1P1拮抗劑篩選模型對治療炎癥和心血管等疾病具有重要意義。

發明內容

本發明在采用鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋找先導化合物，發現了一類二咖啡酰基奎尼酸類鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑，為新型的抗炎藥開發提供先導化合物。本發明可為此類臨床抗炎治療藥物的開發提供先導化合物，為新型抗炎藥物開發提供線索和實驗依據。

本發明的技術方案為：在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸1受體，建立鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑靶向激動劑高通量篩選模型，初篩，復篩，構效關系分析，得到一類具有抗炎作用的候選藥物。具體步驟如下：

步驟一：建立及培養穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CHO細胞株。

步驟二：激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的EC₈₀。

步驟三：拮抗劑模型建立及陽性性藥驗證。

步驟四：采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行鞘氨醇-1-磷酸1受體拮抗劑的高通量篩選，得到有明顯量效關系的化合物。

附圖說明：

圖1：激動劑量效曲線

圖2：拮抗劑量效曲線

圖3：先導化合物量效曲線

具體實施方式

1.實驗材料

(1)完全培養：DMEM；10％FBS；100U/mLPenicillin；100μg/mLStreptomycin；1000μg/mLG418。

(2)StimulationBuffer(SB)：含1mMIBMX的DMEM。

(3)主要儀器：CO₂培養箱；384孔板；Paradigm^TMDetectionPlatform。

2.建立及培養穩定轉染鞘氨醇-1-磷酸1受體的CHO鞘氨醇-1-磷酸1細胞株。

3.最佳細胞數確定

(1)配制Forskolin梯度稀釋液：需要用Forskolin對細胞進行刺激，所以應將Forskolin儲備液逐級稀釋為最終濃度的2倍。

(2)配制不同濃度的細胞稀釋液：用SB將1.(7)中重懸好的細胞分別稀釋為200cells/μL、400cells/μL及800cells/μL。

(3)加樣：將3.(1)中稀釋好的Forskolin溶液按每個濃度2個復孔，5μL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5μL的SB作為cellnegativecontrol(CNC)。接著向不同濃度的Forskolin溶液及CNC中加入3.(2)配制好的不同濃度的細胞稀釋液各5μL。將384孔板在500rpm下離心15s，使10μL試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。