[發(fā)明專利]一種基于熒光共振能量轉移技術的阿爾法1D受體篩選模型

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• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105420339A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設計）人: 嚴明;霍婧婷;俞沁瑋;張陸勇
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.腎上腺素α_1D受體拮抗劑藥物篩選模型，其特征在于，包括步驟：

(1)α_1D受體拮抗劑篩選模型的建立與優(yōu)化；

(2)陽性藥驗證模型可靠性；

(3)高通量篩選模型驗證。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中T25中培養(yǎng)的細胞貼壁度要達到80％，達到對數(shù)生長期，細胞密度為1.5×10⁵cells/mL。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)用于確定細胞數(shù)、驗證陽性藥及篩選α_1D拮抗劑試驗的CHO/α_1D細胞應是復蘇后至少傳代3次且達到穩(wěn)定生長狀態(tài)的細胞。于實驗前將其用PBS潤洗細胞一次，接著用0.5mMEDTA消化，離心，去除上層液體，最后將細胞用適量SB重懸至所需細胞密度。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)配置IP-one標準稀釋液、激動劑腎上腺素(Epinephrine)梯度稀釋液需按照給定濃度配置，細胞分別稀釋為6000cells/μL、4000cells/μL及2000cells/μL。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)加樣方法：a：將配置好的IP1標準稀釋液加入384白板中，每孔10μl，三個復孔；b：將稀釋好的腎上腺素溶液按每個濃度3個復孔，5μl每孔加入384孔板中，接著向其中分別加入配制好的不同濃度的細胞稀釋液5μl。此時標準曲線和反應孔反應體積均為10μl。將TopSeal-A膜貼于板面并37℃孵育1h。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)終止試劑配置：用Lysisbuffer(LB)將IP1-d2及anti-IP1稀釋33倍，按1∶1混勻平衡室溫后加入各孔，每孔10μL。將384孔板在500rpm下離心5s，使20μL試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育1h。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)配制α1D拮抗劑塔索羅辛(Tamsulosin)梯度稀釋液：拮抗劑塔索羅辛母液濃度為100mM，用IP1StimulationBuffer逐級稀釋為終濃度的4倍。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)加樣方法：將稀釋好的塔索羅辛溶液按每個濃度3個復孔，2.5μL每孔加入384孔板中。將配制的細胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心5s，使7.5μL試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育30min。將腎上腺素母液稀釋成步驟(2)中測定的EC₉₀，每孔2.5μl加入對應的含HEAThydrochloride的384孔板中。將384孔板在500rpm下離心5s，使10μL試劑混合均勻以充分反應。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于37℃/5％CO₂下使之孵育45min。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)按步驟(2)配制終止試劑。向每孔加入10μLIP1-d2/anti-IP1溶液(1∶1)。將384孔板在500rpm下離心5s，使20μL試劑混合均勻以充分反應。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育1h。

10.權利要求1-10中所述任一所述的方法在篩選腎上腺素α_1D受體拮抗劑藥物的應用。