[發明專利]利用枸杞茉莉酸代謝途徑重要酶基因提高植物抗逆性的方法

有效

• 申請號: 201510826666.7
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105296457B
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 季靜;王罡;曹海燕;賈翠翠;柳潔;張旭強
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N9/88;C12N9/02;C12N15/61;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/82;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙尊生

1.一種利用枸杞茉莉酸代謝途徑重要酶基因提高植物抗逆性的方法，該植物為擬南芥，其特征在于包括的步驟：

將陽性擬南芥用200uMNaCl/0.5cm打孔器/4℃/處理后，在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h小時取葉片；葉片RNA 的分離 采 用 RNeasy Plant Mini Kit試劑盒,用分光光度計測定OD₂₆₀ 和OD₂₈₀ 值，根 據OD₂₆₀/OD₂₈₀值判斷RNA的質量，用瓊脂糖凝膠電泳檢測的RNA的完整性；RNA提取按照該試劑盒說明書進行；具體步驟為：

1）稱取100 mg的枸杞葉片，在液氮中研磨至細粉末狀，轉到RNase-free、液氮預冷的2mL離心管中，使液氮揮發，但樣品不能解凍；

2）加入450 μL含有v/v 的1%β-巰基乙醇的RLT Buffer，用力振蕩，56 ℃水浴1-3 min；

3）將裂解液轉移至放在2 mL收集管上的紫色QIAshredder離心柱上，12000 r/min，離心2 min，棄掉離心柱，將上清液轉移至新的離心管中；

4）加入200 μL的100%乙醇到裂解液中，用移液器快速混勻；

5）將混勻后的溶液轉移至放在2 mL收集管上的粉色RNeasy離心柱上，12000 r/min，離心15 s，棄掉濾液；

6） 加入700 μL的RW1 buffer到粉色RNeasy離心柱中，12000 r/min，離心15 s，棄掉濾液；

7）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy離心柱中，12000 r/min，離心15 s，棄掉濾液；

8）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy離心柱中，12000 r/min，離心2 min，小心移走2 mL收集管；

9） 將粉色RNeasy離心柱轉移至新的2 mL收集管中，12000 r/min，離心1 min；

10）再將粉色RNeasy離心柱轉移至新的1.5 mL收集管中，加入50 μL RNase-free的無菌水，12000 r/min，離心1 min；

11） 將步驟10）中收集管內收集到的液體再次轉移至粉色RNeasy離心柱中，12000 r/min，離心1 min；

12）取2 μL枸杞葉片總RNA在含有2%甲醛的w/v為 0.7%的瓊脂糖凝膠中檢測，測定RNA濃度；

用TransScript^TM one –step gDNA Rmoval and cDNA synthesis SuperMIx合成cDNA第一鏈；反應體系為：TotalRNA 5ul,Random Primer，0.1ug/ul， 1ul，2×TSReaction Mix10ul,TransScript^TM 1ul，gDNA Remover 1ul，RNase-free Water 2ul；反應條件為25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min；

將合成的cDNA稀釋10倍后作為模板；設計引物qPCRAOS15’-AGCAACCATTTCTTCTTCCT

CG-3’,qPCRAOS25’-GTCACGTTCATTGAGCTCGT-3’,qPCRAOC1:5’-GATCTTGTCCCCTTCAGCAA-3’，qPCRAOC2：5’-AGATCTTGTCCCCTTCAGCA-3’，qPCROPR1:5’-TCATCTTGACGCCATGGACT

-3’，qPCROPR2:5’-ATGTGCCTCCTCCTCTTCAC-3’用TransStart^TM Top Green qPCRSuperMix做RT-qPCR；反應體系為：Forward Primer，10uM， 0.5ul，Reverse Primer，10uM，0.5ul，2×TransStart^TM Top Green qPCR SuperMix 12.5ul，passive Reference Dye，0.5ul Template 1ul ；反應條件為 94℃ 30s,94℃ 5s ，60℃ 15s，72℃ 10s，40個循環；

處理數據后得到結果說明鹽、低溫、受傷處理后茉莉酸代謝途徑三個關鍵酶基因LmAOS/AOC/OPR表達量提高，而且轉基因擬南芥比非轉基因擬南芥的長勢好。