[發明專利]一種荔枝霜疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510820020.8
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105349655B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 李本金;陳慶河;劉裴清;劉小麗;黃宏臻;翁啟勇
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種荔枝霜疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于荔枝霜疫霉菌特異分子檢測。主要采用設計了一對荔枝霜疫霉菌的特異引物PvYF1：5’?GTCCGAGTTTCTAGCAGATTG?3’和PvYR1：5’?ACGATAATACCGTGAGCGCC?3’），經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在荔枝霜疫霉菌純DNA、帶菌的植株中特異性地擴增出片段長度為249bp的特異擴增產物。所發明的特異分子檢測引物及其用法可用于生產實踐中荔枝霜疫霉菌感染的植株中疫霉菌的快速、靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為荔枝霜疫霉菌引起的病害的防治提供可靠的技術和理論依據。

技術領域

本發明一種荔枝霜疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于荔枝霜疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間荔枝霜疫霉病早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域。

背景技術

荔枝味佳、色美、營養豐富，是熱帶和亞熱帶地區水果，分布遍及海南、福建、廣西、廣東、臺灣等省，具有重要經濟價值。由荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii) 引起的荔枝霜疫霉病是荔枝最重要病害之一，嚴重影響荔枝產量、品質以及鮮果貯運和外銷。該病最早在我國的臺灣省發現，目前在福建、廣東、廣西、海南、云南、貴州、四川、臺灣等地均有發生，不僅嚴重為害接近成熟的果實，也為害嫩梢、葉片、花穗、結果小枝、果柄及幼果，引起大量落果和爛果，產量損失高達80%以上，甚至絕收，造成巨大經濟損失。近幾年該病流行頻率和流行程度有逐漸加重的趨勢，已成為荔枝生產上的一個重要障礙。鑒于荔枝霜疫霉病的巨大破壞性，為防止該病擴散蔓延，建立快速有效的檢測方法十分必要。

目前對荔枝霜疫霉病的檢測大多仍沿用傳統培養和血清學鑒定方法。傳統的病原菌檢測技術是在分離培養獲得相應病原物的基礎上，通過形態學觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個過程常常需要耗費大量的勞動力和時間，一般需要幾天才能完成，而且要求操作者具備專業的病原菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗，因此以病原菌形態學特征為判斷基礎的傳統病原菌診斷方法，因其耗時長，效率低，難以滿足對荔枝霜疫霉病診斷的實際需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期。免疫血清學鑒定方法雖已建立，但血清的制備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應，容易造成假陽性，這些方法的應用均受到一定的限制。

近年來隨著分子生物學技術的發展，以PCR技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用，尤其是聚合酶鏈式反應(PCR)技術的應用在很大程度上彌補了傳統方法的不足。這類方法普遍具有快速、準確、靈敏且不需要進行病原菌的分離培養的特點，在控制植物病害的傳播、成災中已經開始發揮重要作用。國內外學者利用基于ITS堿基序列設計引物對卵菌的分子檢測開展研究，但是以ITS為靶序列設計引物存在難以區分近似種的問題。已有研究表明，三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白基因(Ypt1)是一個與原癌基因Ras(Ratsarcoma)相關的基因，在酵母中同，該基因編碼一個與Ras相關GTP結合蛋白。Ypt1基因含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內顯子在不同種之間具有多變性，其保守序列和進化區域相互間隔，非常適合作為霜疫霉菌分子檢測的靶標。因此，本研究分析了荔枝霜疫霉菌與其它30種卵菌在Ypt1基因序列上的差異，設計了特異性引物，并在此基礎上建立了荔枝霜疫霉菌的PCR快速分子檢測體系。此技術可應用于荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，對于確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學依據。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中荔枝霜疫霉菌傳統檢測方法對操作者的實驗技能和實際經驗有很高的要求，且十分耗時，無法達到快速檢驗的問題，提供荔枝霜疫霉菌的特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速分子檢測體系和程序。該方法可用于帶菌植株的高靈敏度快速分子檢測，此技術對于荔枝霜疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。