[發(fā)明專利]一種信號(hào)肽及其在利用魔芋粉產(chǎn)γ-氨基丁酸重組菌中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510817132.8
• 申請(qǐng)日: 2015-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN105255957A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;鄭俊賢;徐美娟;楊套偉;張顯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P13/00
• 分類號(hào): C12P13/00;C12N1/20;C12R1/13
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 耿曉岳

技術(shù)領(lǐng)域

利用一種信號(hào)肽使重組菌高效分泌特定酶代謝廉價(jià)碳源進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)的方法和高效生產(chǎn)某種蛋白的方法，屬于基因工程、蛋白質(zhì)與酶工程和代謝工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其來(lái)源是非糧食作物魔芋。據(jù)相關(guān)報(bào)道在我國(guó)云南、貴州、四川、湖北和湖南的西部、陜西南部等地均適宜魔芋種植，目前已有一定的規(guī)模，僅湖北省魔芋種植面積就達(dá)41萬(wàn)畝。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作為功能性食品，應(yīng)用還不是很廣泛。大部分微生物無(wú)法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品具有良好的應(yīng)用前景。現(xiàn)國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，改造釀酒酵母直接以淀粉為碳源生產(chǎn)乙醇，導(dǎo)入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒狀桿菌利用可溶性生產(chǎn)L-賴氨酸的相關(guān)報(bào)道，未見有以魔芋粉底物的相關(guān)微生物改造。

本研究室前期工作已獲得通過(guò)相關(guān)基因工程和代謝工程技術(shù)改造的一系列以葡萄糖糖為底物高產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌種：天津短桿菌SW07-1/pGAD。

發(fā)明人獲得的高產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌種只能以葡萄糖為主要碳源發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸，不能直接利用魔芋粉作為主要碳源。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是天然存在于某些生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，其為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有抗焦慮、降血壓、鎮(zhèn)定安神、增強(qiáng)記憶、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、利尿，鎮(zhèn)痛等生理功能，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。通過(guò)基因工程和代謝工程技術(shù)進(jìn)一步改造高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種，使其能利用魔芋粉作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸。對(duì)簡(jiǎn)化γ-氨基丁酸生產(chǎn)工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本有一定的參考應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)將去除自身信號(hào)肽的β-甘露聚糖酶基因與來(lái)源谷氨酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌的Sec和Tat兩個(gè)主要分泌途徑的十二條信號(hào)肽分別融合，替換對(duì)比不同信號(hào)肽引導(dǎo)分泌β-甘露聚糖酶基因在不同γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌的效果，得到經(jīng)密碼子優(yōu)化的β-甘露聚糖基因信號(hào)肽——MannaseSignalPeptide(MSP)為分泌胞外酶效果較好的一種新發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。

所述MSP核苷酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。

本發(fā)明在已有高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌種的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因工程技術(shù)不同信號(hào)肽引導(dǎo)分泌β-甘露聚糖基因在構(gòu)建的不同γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌中表達(dá)。使其能以魔芋粉和葡萄糖作為混合碳源進(jìn)行γ-氨基丁酸發(fā)酵。

本發(fā)明構(gòu)建的重組天津短桿菌SW07-1/pGAD-pMSPman優(yōu)化后5L發(fā)酵96hγ-氨基丁酸發(fā)酵的產(chǎn)量為45.5±0.9g/L，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶的酶活為1203±6.8U/mL。(碳源添加方式：初始10g/L魔芋粉和30g/L葡萄糖，后期分批補(bǔ)加80g/L魔芋粉。)

所述的技術(shù)方案：

1.根據(jù)NCBI上公布的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)信號(hào)肽和目的基因融合引物。

2.重組菌的構(gòu)建

從相關(guān)菌種中抽提染色體DNA為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物、PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。用相同的限制性內(nèi)切酶相關(guān)表達(dá)載體和純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物并用凝膠回收試劑盒對(duì)其回收，并用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。將酶切后的載體和PCR產(chǎn)物按一定比例混合，在T4DNA連接酶的作用下過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物用CaCl₂轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliBL21，獲得含重組質(zhì)粒的E.coliBL21。提取質(zhì)粒，通過(guò)單雙酶切及PCR驗(yàn)證后用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入相關(guān)菌種中。最后，將含15％甘油的重組菌液保存-70℃冰箱。

3.重組菌的產(chǎn)酸培養(yǎng)

將重組菌接種于新鮮的LB+0.5％Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1％。次日以1％轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中(底物為魔芋粉和葡萄糖混合)，0.8mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，生長(zhǎng)后期收集發(fā)酵液利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定其氨基酸含量(γ-氨基丁酸及相關(guān)氨基酸等)。發(fā)酵培養(yǎng)基具備微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，并通過(guò)相關(guān)優(yōu)化。

4.重組菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)

將重組菌接種于新鮮的LB+0.5％Glucose液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，接種量為1％。次日以1％轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中(底物為葡萄糖)，0.8mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，生長(zhǎng)后期收集發(fā)酵液測(cè)其酶活和蛋白含量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：信號(hào)肽引物與β-甘露聚糖酶串聯(lián)的引物設(shè)計(jì)