[發明專利]一種基于相干反斯托克斯拉曼散射效應的超分辨顯微成像方法

有效

• 申請號: 201510816948.9
• 申請日: 2015-11-23
• 公開（公告）號: CN105352936B
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 倪赫;鄒麗敏;李靖韜
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 陳潤明

一種基于相干反斯托克斯拉曼散射效應的超分辨顯微成像方法，它涉及一種成像方法。本發明的目的是為了解決現有技術的光學顯微成像方法成像時間長，成像光路復雜，對成像結構要求高的問題。本發明將泵浦光、斯托克斯光和探測光共線聚焦于樣品，調整泵浦光、斯托克斯光和探測光的聚焦光斑中心的距離使三束光斑邊緣相互重疊，形成三束光聚焦光斑的共同重疊區域；向外側移動泵浦光、斯托克斯光和探測光聚焦光斑中心，減小共同重疊區域的面積。本發明光路結構相對簡單，易于實現。

技術領域

本發明涉及一種成像方法，具體涉及一種基于相干反斯托克斯拉曼散射效應的超分辨顯微成像方法，屬于光學顯微成像技術領域。

背景技術

長期以來，光學顯微成像技術的分辨力受到衍射極限的限制。至今，利用非標記的方法獲得突破衍射極限分辨率的方法有兩種，一種是利用場增強效應的相干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡，但它要用到尖端場增強，只能對樣品表面成像，應用受到很大的限制。另一種方法是受激拉曼顯微成像，它使用兩束斯托克斯光，一束呈高斯型，另一束呈環形，類似熒光標記的STED方法。但這種方法只能獲得分子某一化學鍵的拉曼譜，單靠此譜來判別樣品中的分子種類是困難的，要獲得分子的其它拉曼譜，就要求激光器具有寬的調諧范圍，更嚴重的問題是需要很長的測試時間才能獲得分子的完整拉曼譜，為獲得樣品的三維超衍射分辨圖像，所需成像時間太長。

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：Coherent Anti-Stokes Raman Scattering)是利用四波混頻的三階非線性效應而產生反斯托克斯光信號的效應，現有技術中通過增加一與泵浦光和斯托克斯光同時共線聚焦于樣品的附加探測光，該附加探測光耗盡泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周邊產生的聲子，形成無用的CARS信號，而延遲的探測光中符合相位匹配條件的光子則與焦斑中心區域的聲子碰撞形成有用的CARS信號，將無用的CARS信號分離，即可獲得超衍射極限的空間分辨率。因采用具有寬帶的超連續譜激光作為泵浦光和斯托克斯光，從而獲得分子的完整CARS譜信號，實現對整個分子成像。然而，該方法所需的激光波長為4種，光路復雜且對調節機構要求很高，實現起來極為困難；公開號為CN102608100A的專利文獻公開了一種“利用光纖產生的四波頻信號進行CARS成像的系統及方法”，其將四波混頻信號作為CARS成像的探針光，與一束泵浦光和一束斯托克斯光構成三束光聚焦在樣品上進行三色CARS成像，解決現有技術的光學顯微成像方法成像時間長，成像光路復雜，對成像結構要求高的問題。根據該專利文獻，發明人想到，若能夠在此技術基礎上進一步提高成像分辨率，則會獲得突破衍射極限的成像分辨率。

發明內容

本發明的目的是為了解決如何提高泵浦光、斯托克斯光和探測光進行CARS成像的成像分辨率的問題，提供了一種基于相干反斯托克斯拉曼散射效應的超分辨顯微成像方法。

本發明的技術方案是：一種基于相干反斯托克斯拉曼散射效應的超分辨顯微成像方法，包括以下步驟：

步驟一、將泵浦光、斯托克斯光和探測光共線聚焦于樣品，調整泵浦光、斯托克斯光和探測光的聚焦光斑中心的距離使三束光斑邊緣相互重疊，形成三束光聚焦光斑的共同重疊區域；

步驟二、在步驟一的基礎上沿三個不同方向向外側移動泵浦光、斯托克斯光和探測光聚焦光斑中心，減小所述共同重疊區域的面積；

步驟三、獲取由共同重疊區域所產生的反斯托克斯光信號進行成像。

所述泵浦光、斯托克斯光和探測光均為超短激光脈沖。

所述泵浦光、斯托克斯光和探測光的聚焦光斑中心連線的距離近似相等。

所述泵浦光、斯托克斯光和探測光為空心光束。