[發明專利]兔特異性引物、試劑盒及其在兔源性成分鑒定中的應用

有效

• 申請號: 201510814626.0
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105349653B
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 劉榜;王文君;吳清清;張慶德
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

本發明提供了一種兔特異性引物、試劑盒及其在兔源性成分鑒定中的應用，屬于動物種源性成分分子檢測技術領域。本發明中，兔特異性引物是能特異性擴增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或該序列的特異性片段的引物對SEQ ID No.2&3。本發明試劑盒包括所述兔特異性引物、反應試劑以及陽性和空白對照。采用本發明的引物擴增樣品DNA，對PCR擴增產物進行分析，可判定樣品中是否含有兔源性成分。本發明為肉制品和毛皮中兔源性成分的檢測提供了有效、精準、可靠的手段，具有簡便、快速、全面、特異性強的特點，且成本較低，適用性廣。

技術領域

本發明涉及動物分子生物學領域，具體涉及兔特異性引物、試劑盒及其在兔源性成分鑒定中的應用。

背景技術

兔肉性涼味甘，在國際市場上享負盛名，被稱之為“保健肉”、“葷中之素”、“美容肉”、“百味肉”等等。兔肉質地細嫩，味道鮮美，營養豐富，與其它肉類相比較，具有很高的消化率(可達85％)，食后極易消化吸收。因此，兔肉極受消費者的喜愛。

隨著人民生活水平的提高，兔肉消費量的增加，市場上開始出現各種兔肉制品摻假的現象，因此兔肉制品來源的安全性成為消費者關心的焦點，而對肉制品的來源進行鑒定并建立便捷的檢測方法是解決這一問題的關鍵?？茖W家針對進化上較不保守的線粒體DNA，利用NCBI核酸序列數據庫，通過比對各種動植物的線粒體Cytb基因序列，設計不同物種的特異性引物來進行物種種源鑒定。Cristina G.Santos采用這種方法設計了野兔的線粒體Cytb基因特異性引物并進行了檢測，但由于線粒體DNA的高度變異性，該特異性引物只能對少數野兔種進行鑒別，是否可用于家兔的鑒定未見研究報道。因此，如何有效、準確地判別肉制品是否含有兔源性成分，并建立一種簡單易行的檢測方法是十分必要的。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術不足，提供一種可用于兔源性制品特異性檢測的引物；

本發明的第二個目的在于提供用于兔源性制品檢測的檢測試劑盒；

本發明的目的還在于提供兔源性成分的鑒定方法。

為實現上述目的，本發明從種內一致性和穩定性、種間特異性、拷貝數等方面進行兔基因組特異DNA序列的篩選，經過普通牛、水牛、羊(綿羊、山羊)、豬、馬、驢、鼠(大鼠、小鼠、倉鼠)、豚鼠、雞、鴨、鵝、兔、狗、狐、水貂和貉子的基因組DNA及不同的兔品種DNA中的檢測，篩選在兔中特意的、在其他物種中不存在或同源性低的DNA片段作為檢測分子。經過大量分析和實驗工作，最終獲得可供檢測使用的特異DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

基于此，本發明首先提供一種兔特異性引物，其能特異性擴增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或該序列的特異性片段。

優選地，引物長度為18～27bp。引物的設計需要考慮是否容易發生錯配、擴增片段長度、反應溫度等多方面。

優選地，該引物序列如下：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′；

或該引物向5′、3′端延伸或修飾得到的仍能特異性擴增SEQ ID No.1所示序列的引物。

進一步本發明提供含有上述特異性引物的檢測試劑盒。

優選地，所述試劑盒還包括下述試劑中的一種或多種：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR緩沖液、陽性對照DNA模板、雙蒸水；或者還包括下述試劑中的一種或多種：Taq DNAMasterMix、陽性對照DNA模板、雙蒸水。

所述陽性對照DNA模板為兔科兔屬的兔基因組DNA模板；