[發明專利]一種基于納米金生長的可視化免疫分析方法

有效

• 申請號: 201510814220.2
• 申請日: 2015-11-23
• 公開（公告）號: CN105445453B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 郭隆華;李言言;馬小明;林振宇;邱彬;陳國南
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種基于納米金生長的可視化免疫分析方法，屬于分析化學和納米科技領域。

背景技術

比色傳感器由于它的簡單和實用性已經廣泛應用于科研和工業領域。該傳感器可以用紫外儀器檢測，甚至可以肉眼檢查，因此非常適用，例如應用在即時測試和環境食品檢測方面。一個理想的比色傳感器應該至少滿足以下幾個方面：高靈敏性，適用的分析物范圍廣，裸眼檢測。本發明中我們展示了一種比色傳感器，基于傳統酶聯免疫反應和酶誘導的金棒生長相結合，幾乎可以滿足以上提到的所有條件。

酶聯免疫反應是一種廣泛應用的免疫分析方法，它利用了酶的生物特性和抗體抗原的特異性結合。由于酶較高的生物特性和抗體抗原的特異性識別，保證了該免疫方法具有較高的靈敏性和特異性，因此酶聯免疫反應能夠用于檢測較寬范圍的目標物。該方法已經廣泛的應用于很多方面，例如，臨床診斷，環境監測，食品質量監控，科研研究等。傳統的酶聯免疫反應，信號的產生是由于酶底物轉變為有色物質，并且隨著目標物濃度的升高，溶劑的顏色逐漸加深。單一顏色的強度變化人眼不易觀察，因此裸眼只能定性檢測，需要借助酶標儀來定量檢測，限制了即時檢測的實用性。

目前，關于可視化檢測抗體-抗原反應的方法已有很多相關報道，例如蔣興宇等2014年公開了一種新型抗體-抗原檢測方法的專利CN104089950A，該方法結合了酶聯免疫反應和點擊化學反應，利用貴金屬特殊的光學性質，實現對目標物的可視化檢測。該發明的重點在于，利用酶催化底物產生抗壞血酸，它能將二價銅離子還原為一價銅離子，通過表面功能化的金納米粒子和一價銅催化的點擊化學反應來可視化地分析堿性磷酸酶的含量；結合酶標記抗體技術，將堿性磷酸酶標記的抗體用于抗原-抗體相互作用的免疫分析中，利用上述可視化分析堿性磷酸酶的方法可達到可視化分析抗原-抗體相互作用的目的，通過肉眼觀察金納米粒子的溶液顏色從紅色變成藍色或紫色，從而實現對待檢測樣品中抗原抗體反應的可視化檢測。

本發明中，我們展示了一種酶誘導納米金棒生長的等離子體共振酶聯免疫分析方法。貴金屬納米粒子由于其獨特的光學性質應用于研究的各個方面，金棒作為一種顏色變化較為豐富的種類，更是備受喜愛。該方法的發明基于商業化的堿性磷酸酶酶聯免疫反應體系，堿性磷酸酶是一種水解酶，它能夠從許多分子上脫去磷酸基團。該發明體系中，堿性磷酸酶用于去除抗壞血酸過磷酸酯上的磷酸基團產生還原劑抗壞血酸。一定量的金核和金棒生長液存在下，反應產生的不同量的抗壞血酸用于還原氯金酸，能夠形成不同尺寸和縱橫比的納米金棒，因此，當體系中存在不同濃度目標物時，金棒的形態不同，對應的顏色也不同，從而實現對目標物的可視化定量檢測。

發明內容

本發明針對現有儀器操作復雜、價格昂貴，傳統可視化酶聯免疫吸附法顯色單一、定量效果差等問題，提出了一種快速、靈敏、多色彩的可視化檢測分析方法。

為了實現上述目的，本發明所述的一種可視化酶聯免疫分析方法，利用堿性磷酸酶（ALP）與抗壞血過磷酸酯（AA-P）反應生成還原劑抗壞血酸（AA），在金棒生長液和金核同時存在下，利用生成的不同量的AA還原氯金酸生成單質金沉積在金核表面，從而得到不同大小的金棒，表現出溶液顏色和紫外吸收光譜圖特征隨目標物濃度變化，用于目標物的可視化定量測定。

一種可視化酶聯免疫分析方法包括以下步驟：

（1）向已包被有目標捕獲抗體的酶標板中加入不同濃度的能與之特異性結合的抗原100μL，反應1h；

（2）向步驟（1）中加入ALP標記的100μL試劑盒自身配帶的已經標記有堿性磷酸酶的檢測抗體，反應1-2h；

（3）向步驟（2）中加入50μL抗壞血酸過磷酸酯（購自于sigma公司）與ALP反應1h；

（4）移取步驟（3）所得到的反應液20μL至220μL金棒生長液中，隨后加入10μL預先采用NaBH₄還原法合成好的納米金核溶液，混勻反應1h后，使用酶標儀測吸收光譜，并使用數碼相機記錄下溶液的顏色；

（5）處理步驟（4）所得到的數據，并繪制工作曲線。

（6）按照上述實驗步驟，檢測模擬待測樣品。

所述的金棒生長液為包含有終濃度為0.1MCTAB、0.06mMAgNO₃、0.5mMHAuCl₄的混合液。