[發明專利]一種采用多重內引物進行恒溫擴增核酸的方法及應用

有效

• 申請號: 201510812948.1
• 申請日: 2015-11-22
• 公開（公告）號: CN105349526B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

1.一種恒溫擴增核酸的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，設定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c-1，第三任意序列F1c-1，第四任意序列F2c-2，第五任意序列F1c-2，自所述目的基因片段的5’端起，設定第六任意序列B3，第七任意序列B2-1，第八任意序列B1-1，第九任意序列B2-2，第十任意序列B1-2；

(2)提供引物FIP1，所述引物FIP1含有與序列F2c-1互補的序列F2-1，在所述序列F2-1的5’端連接有序列F1c-1，提供引物FIP2，所述引物FIP2含有與序列F2c-2互補的序列F2-2，在所述序列F2-2的5’端連接有序列F1c-2，提供引物BIP1,所述引物BIP1含有序列B2-1，在所述序列B2-1的5’端連接有與序列B1-1互補的序列B1c-1，提供引物BIP2，所述引物BIP2含有序列B2-2，在所述序列B2-2的5’端連接有與序列B1-2互補的序列B1c-2，提供引物F3，所述引物F3含有與序列F3c互補的序列F3，提供引物B3，所述引物B3含有序列B3；在序列F2c-1和F1c-1之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LF1，在序列F2c-2和F1c-2之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LF2，在序列B2c-1和B1c-1之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LB1，在序列B2c-2和B1c-2之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LB2；

(3)在鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調節劑、引物、和緩沖液存在下，使用目的基因片段作為模板在63～65℃中擴增DNA；

(4)檢測步驟(3)的擴增結果。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的檢測為可視顏色變化法檢測、電泳檢測或實時熒光檢測。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述鏈移位型聚合酶為Bst DNA聚合酶、所述解鏈溫度調節劑為甜菜堿。

4.權利要求1所述的方法在檢測單增李斯特菌中的非診斷目的的應用，其特征在于，所述引物FIP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述引物FIP2的序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物BIP2的序列如SEQ ID NO:3所示，所述引物BIP1的序列如SEQ ID NO:4所示，所述引物F3的序列如SEQ ID NO:5所示，所述引物B3的序列如SEQ ID NO:6所示，所述引物LF1的序列如SEQ ID NO:7所示，所述引物LF2的序列如SEQ ID NO:8所示，所述引物LB2的序列如SEQ IDNO:9所示，所述引物LB1的序列如SEQ ID NO:10所示。

5.一種檢測單增李斯特菌的試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，設定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c-1，第三任意序列F1c-1，第四任意序列F2c-2，第五任意序列F1c-2，自所述目的基因片段的5’端起，設定第六任意序列B3，第七任意序列B2-1，第八任意序列B1-1，第九任意序列B2-2，第十任意序列B1-2時，提供引物FIP1，所述引物FIP1含有與序列F2c-1互補的序列F2-1，在所述序列F2-1的5’端連接有序列F1c-1，提供引物FIP2，所述引物FIP2含有與序列F2c-2互補的序列F2-2，在所述序列F2-2的5’端連接有序列F1c-2，提供引物BIP1,所述引物BIP1含有序列B2-1，在所述序列B2-1的5’端連接有與序列B1-1互補的序列B1c-1，提供引物BIP2,所述引物BIP2含有序列B2-2，在所述序列B2-2的5’端連接有與序列B1-2互補的序列B1c-2，提供引物F3，所述引物F3含有與序列F3c互補的序列F3，提供引物B3，所述引物B3含有序列B3，在序列F2c-1和F1c-1之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LF1，在序列F2c-2和F1c-2之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LF2，在序列B2c-1和B1c-1之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LB1，在序列B2c-2和B1c-2之間選取區段設計與所述區段反向互補的引物LB2；

(2)鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調節劑、恒溫擴增緩沖液。